鱿鱼墨多肽对SKBR3细胞的增值抑制究【毕业开题、综述、正文】

开题报告药学鱿鱼墨多肽对SKBR3细胞的增值抑制研究一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义癌症已经成为影响人类生命健康与致死的重要因素,经典的化疗药物虽然可以在一定程度上抑制肿瘤生长，但同时也损害了患者的正常细胞与器官，给病人带来极大的痛苦。

随着海洋药物和肿瘤细胞分子生物学研究的快速进展，恶性肿瘤的细胞内信号转导、细胞凋亡的诱导、细胞的转移、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正逐渐被阐明。

以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(蛋白酪氨酸激酶、芳香化酶、拓朴异构酶I等)作为药物筛选靶点已经被大量研究,并由此发现了选择性地作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药,即分子靶向药(Molecular targeted drugs， MTD) 和抗体靶向药(Antibody targeted drugs，ATD)，该类型药物已成为当今世界各国抗肿瘤药物研发的重要方向。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国女性恶性肿瘤中居第二位，且呈明显上升的趋势，尤其在一些沿海发达地区，如上海市，其发病率在2000年已跃居女性恶性肿瘤发病率之首。

所以能找到一种特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药尤为重要。

生物活性肽（biologically active peptides）是指那些具有特殊生理活性的肽类，是世界上药物及保健品研究的热点，目前通过提取生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，如牛乳酯蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。

海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。

近年来对海洋生物活性肽 ,特别是抗肿瘤活性肽的研究取得了很大进展。

人们现如今所提取的抗肿瘤蛋白主要有从海鞘、海绵、软体动物、珊瑚中提取的环行多肽，从贝类、海参、乌贼墨等中提取的糖蛋白，还有从海藻、鲎、鲨鱼软骨中提取的多肽。

但是由于海洋资源的开发利用较晚，海洋活性肽尚未形成规模产业，因此，借鉴陆地活性肽开发的酶工程技术，以海洋生物蛋白资源为原料，通过对酶解、制备等工艺的综合研究，即可研制出陆地蛋白源和化学合成所无法生产的系列天然、高效、新颖的生物活性肽。

鱿鱼盛产于我国渤海、黄海等海域，现代研究表明，鱿鱼蛋白质含量较高，并含有丰富的维生素、微量元素及较高含量的不饱和脂肪酸，被作为防治动脉粥样硬化及预防高血压的保健食品。

已有研究表明,鱿鱼蛋白提取物有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒和抗菌等功能，具有增加机体免疫能力、降低血脂含量的功效。

浙江海洋学院地处海岛，附近海域鱿鱼十分丰富，仅嵊泗县鱿鱼年产量就达5吨左右，样品采集方便，价格较低。

长期以来，对于鱿鱼的开发利用以鲜品为主，部分被加工成为干品及罐装品，所有这些产品都未能使鱿鱼的药用价值得到利用。

近年来，研究人员开始从鱿鱼中提取多糖、蛋白质、多肽等活性物质，试图开发利用其在疾病治疗与预防方面的功能，但是对于鱿鱼酸解多肽抗肿瘤的研究在国内外尚属空白。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：主要内容：1. 酸解工艺部分：选取四种常见的酸，通过正交实验，确定鱿鱼的最佳酸解条件。

本人对该部分的见解：首先，正交实验中各因素与水平的选择要合理；其次，实验号的选择要具有随机性；最后，为了尽可能的减少误差，每个实验号做三个平行实验，取其平均值。

2. 分离纯化部分：以抑制乳腺癌细胞增殖率以及在显微镜下观察的细胞形态为评价标准，通过超滤法、色谱层析等技术分离纯化出具有较强抗乳腺癌细胞增殖的酸解多肽。

本人对该部分的见解：该部分的关键点是色谱柱平衡缓冲液及洗脱液的选择，洗脱流速及洗脱液的收集。

3.酸解物抗乳腺癌作用：选用HE染色法、MTT法、流式细胞术等技术方法，研究酸解多肽对乳腺癌细胞形态的影响、酸解多肽作用浓度对乳腺癌细胞增殖率及凋亡率的影响。

本人对该部分的见解：本部分在三个部分当中具有重要的位置，该部分所采用的方法和技术是整个实验成败的关键，因为本研究的最终目的是分析酸解多肽抗乳腺癌细胞的作用，从而为将来抗肿瘤保健品和药品的开发提供理论和技术支持4.采用mtt法培养肿瘤细胞，研究其抑制作用。

拟解决的主要问题：1.酸解技术的研究。

2.分离纯化过程中超滤技术、层析技术、高效液相色谱等技术的研究。

3.凝胶电泳技术的研究。

4.细胞培养技术、HE染色技术、MTT法、流式细胞术。

三、研究步骤、方法及措施：步骤：1. 选用4种酸进行比较，考虑到酸提料液比、酸的种类、酸解温度及酸解时间对鱿鱼墨多肽的影响，最终确定酸解鱿鱼墨多肽的最佳条件。

2. 利用超滤法、凝胶层析法、离子交换层析法、反相高效液相色谱法等分离纯化出具有高效抗乳腺癌活性的酸解多肽。

3.鱿鱼墨多肽对SKBR3细胞的增值抑制研究。

MTT法研究不同浓度的鱿鱼墨多肽对SKBR3细胞的增值抑制率， HE染色法后在显微镜下观察鱿鱼墨多肽作用后SKBR3细胞的形态。

措施：购买鱿鱼，提取分离出鱿鱼多肽粗提物，。

分析各种因素对于对鱿鱼多肽提取量的影响。

四、参考文献[1] 林志彬.多肽的现代研究[M].第2版,北京:北京医科大学出版社,2001: 157-206.[2] 张志军,李淑芳,刘建华.鱿鱼多肽提取-酶解提条件的研究[J]. 天津农学院学报，2005,12（1）:12-15.[3] 杨瑞瑞,李国华,樊宝娟.灵鱿鱼多肽酶解方法探讨及改进[J]. 陕西中医学院学报,2009,32(5):62 -63.[4] 徐格非,庞秀炳,高向东提取纯化鱿鱼多肽[J].药学与临床研究,2007,15(4):297 - 299.[5] 曹德宾,刘炳明.灵芝多糖水提醇沉工艺初探[J].食用菌, 2000,22(1): 38-[6] 刘恒宇,袁金田,孙国,等.mtt法培养肿瘤细胞的最佳工艺探讨[J].中国中药杂志，2005,30（6）:471-472.毕业论文文献综述药学鱿鱼多肽对SKBR3细胞的增值抑制研究摘要:鱿鱼墨多肽含丰富的维生素和矿物质，具有一定的生理活性，经研究发现多肽对肿瘤细胞还有一定的抑制作用，该实验就是针对SKBR3细胞的增值抑制研究，来说明对肿瘤细胞的抑制作用。

关键词:鱿鱼墨多肽;肿瘤细胞;生理活性近几十年来，生物活性多肽抗肿瘤作用研究一直是国内外研究热点，已从多种陆地生物及海洋生物中分离出了抗肿瘤多肽，部分已应用于临床。

海洋生物具有物种及活性物质富于多样性的特点，当前已被做为各国研究开发的热点，其中抗肿瘤活性物质的筛选进展迅速，大量具有抗肿瘤活性的多肽被分离出来[1-20]。

而在活性多肽的提取方法上，目前的研究已越来越多地集中在蛋白酶解上[2]。

本文以检索项为“题名”，检索词为“活性肽、抗肿瘤”对中国期刊全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国博士论文全文数库进行检索，共检索出35篇文章；以检索项为“题名”，检索词为“酸解”对中国期刊全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国博士论文全文数据库进行检索，共检索到1586篇相关文献，其中大多数文献是有关酸解工艺的研究。

英文文献在"ScienceDirect"网站检索，检索词为：hydrolysate and marine和antitumor and marine，其检索出2946篇文章。

本文重点描述海洋生物抗肿瘤活性肽的研究现状，海洋生物蛋白酸解多肽的生物活性功能及分离纯化方法。

1 生物活性肽的抗肿瘤活性生物活性肽是具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类活性多肽。

这类多肽的活性功能依赖于其分子量大小和氨基酸组成成份及排列顺序，它们通常作用于机体的消化系统、心血管系统、免疫系统和神经系统等多种生命代谢系统，最终起到提高机体免疫力、减少慢性疾病发生的作用。

目前，从海洋中获得的抗肿瘤活性肽大多以天然存在于生物体内的活性肽为主，其宿主来源主要集中在海绵、海鞘、海藻、海兔、芋螺、海葵等生物中。

1.1海鞘多肽目前从海鞘中分离出的活性肽大多为环状多肽,少数为线性肽类。

自1980年从海鞘Lissoclinum patella中发现环肽Ulithiacyclamide以来,又从加利福尼亚海域及加勒比海群体海鞘Trididenum sp.中分离出3 种环肽Didemin A～C, 从Lissoclinum属海鞘中分离出环肽Lissodinamide 4～8 ,从Lissoclinum bistratum属海鞘中分离得到环肽Bistratamide A,B[23]。

1.2海绵多肽截止目前对海绵活性功能研究最多的主要集中于离海绵目、外射海绵目、石海绵目、软海绵目以及硬海绵目等海绵中的环状多肽，已分离出上百种的抗肿瘤多肽。

如来源于Trididemnum solidum 的环肽Didemnin B对L1210白血病细胞的IC50为7. 5×10- 4 mg/ L , 临床研究结果表明它对非何杰金淋巴瘤(non-Hodykins) 和神经胶质母细胞具有较好抑制效果；Cycloxazoline 是来源于Lissoclinum bistratum 的环六肽, 具3个呈对称分布的恶唑啉环，对MRC5CV1成纤维细胞和T24膀胱癌细胞的IC50均为0. 5mg/ L；来源于Botryllus sp.二肽Caledonin 对KB细胞和P388细胞有弱细胞毒性[24]。

1.3鲨鱼软骨多肽鲨鱼软骨中存在一类多肽, 能通过阻止肿瘤周围毛细血管生长而达到抑制肿瘤的作用,对肺癌、肝癌、乳腺癌、消化道肿瘤、子宫颈癌、骨癌等均有抑制作用。

陈建鹤等2000年用盐酸胍抽提姥鲨软骨蛋白,采用超滤和分子筛柱层析等方法分离纯化获得新生血管抑制因子Sp8。

Sp8 在体外能抑制血管内皮细胞增殖, 抑制新生血管生长, 体内能抑制小鼠移植S180肉瘤生长[25]。

2 酶解多肽的活性功能饮食当中的生物活性肽常常以非活性状态存在于蛋白质的氨基酸序列中，通常以3种方式从宿主蛋白质中释放出来发挥活性功能，即肠道消化酶的消化作用、微生物的蛋白水解作用和外源性动植物以及微生物蛋白酶的水解作用[26]。

根据文献报道[27]，生物活性肽一般由2到20个氨基酸残基组成，一种活性肽可以同时表现出多种活性功能。

近几十年来，运用酶解方式从动植物蛋白中获取生物活性肽一直是国内外研究的热点[28-48]，如今酶解蛋白来源正从陆地生物向海洋生物转变，多种海洋生物蛋白被酶解，提取出了具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗凝血等多种生物活性功能的多肽。

2.1 抗氧化活性肽海洋生物蛋白酶解多肽抗氧化活性的相关报道很多。

Song等[49]使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对毛蚶Arca subcrenata蛋白进行酶解，通过正交试验优化酶解条件，经测定各酶解液对DPPH和H2O2自由基的清除作用，证实在所选用的3种蛋白酶中，碱性蛋白酶酶解液对2种自由基的清除能力最强，EC50分别为6.23mg/ml和19.09mg/ml。