医学培训资料—丝状真菌的鉴定

丝状真菌（霉菌）分离筛选方法霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。

霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。

一.丝状真菌（霉菌）分离筛选1.培养基：1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。

注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 32.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.01.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。

临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。

1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。

2.分离纯化：混菌和涂布法将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。

据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。

对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。

根霉菌分离筛选：属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。

可利用形态特征鉴别。

样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。

豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。

【珍藏课件】徐和平：常见丝状真菌鉴定真菌是真核细胞型微生物，其种类繁多，自然界估计多达150万种，分类系统较多，根据形态可分为单细胞和多细胞两类。

单细胞真菌主要为酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌有菌丝和孢子组成，菌丝分枝交织成团形成菌丝体，并长有各种孢子，这类真菌被称为丝状真菌，俗称霉菌。

观察其形态、颜色变化以及真菌不同时期的镜下特征对于正确鉴定真菌具有重要意义。

徐和平老师在真菌学方面拥有丰富的临床经验，今天徐和平老师主要分享常见的丝状真菌鉴定。

温馨提示：因本帖中主要是授课视频和大量图片，建议在WIFI环境下学习！文末有干货！曲霉的基本结构：菌丝：有隔、透明，足细胞分生孢子梗：长短、颜色、表面粗糙程度分生孢子头：顶囊、小梗（瓶梗和梗基）、分生孢子其他结构：壳细胞、闭囊壳、厚壁孢子回顾公益学术活动提到真菌学检验，我们必然想到真菌学青年专家、北京协和医院的王澎老师，她曾多次做客“临床微生物论坛”和“QQ大讲堂”，参与公益学术活动，王澎老师已经离开我们一百多天，但她的音容笑貌仍然深深的印在我们的脑海里，她的学术造诣值得我们去研究学习。

下面就回顾一下2016年4月份她的网络公益讲座：《临床罕见真菌感染病例实验室诊断分享》2016年5月份网络公益讲座：《真菌形态学鉴定思路》践行公益活动之助学山区儿童本人系洛阳市第一中医院检验科陈众，为了帮扶河南省洛阳市嵩县旧县镇龙潭村山区学龄儿童，文末设置二维码所收集到费用均用于公益活动，若有大额资金，将交由村委会统一管理。

活动接受社会监督，资金用途将予以公示。

驻村第一书记：宋军利：138****0002洛阳市第一中医院纪律监察室：*************2016年12月份送物资时拍摄2017年5月2日再次来到龙潭村看望孩子们参与公益活动，可以扫描二维码转账，并注明系公益捐款本文编辑：陈众视频来源：。

ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。

丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。

随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。

本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。

阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。

1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。

1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。

具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。

②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。

③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。

1.4 真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。

PCR反应总体积50μl，10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA 模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。

丝状真菌的快速鉴定及药敏试验彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【摘要】Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi,and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics.Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS.The obtained results were compared with those from microscopic examination.The susceptibility of filamentous fungi was detected by the Etest method.Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS,61 reached to the specieslevel(score≥2.000),36 to the genus level(score between 1.700 and1.999),and 3 failed to be identified (score ＜ 1.700).There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination.The MIC90 of amphotericin B against Epidermophytonfloccosum was 0.19 μg/mL,while that against Aspergillus flavus wa s above 32 μg/mL.The MIC90 of itraconazole against Trichophyton tonsurans,Microsporum canis and Epidermophytonfloccosum were all below 0.38 μg/mL,while that against Aspergillus niger was above 32 μg/mL.The MIC90 of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains.The MIC90 of voriconazole and caspofungin against Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus,Aspergillusniger,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans and Microsporumcanis were ≤0.38 μg/mL and ≤ 1 μg/mL,respectively.Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly,accurately and high-throughput.Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.%目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在丝状真菌鉴定中的作用,分析常用抗菌药物对丝状真菌的药敏试验结果.方法收集100株丝状真菌,采用MALDI-TOF MS进行快速鉴定,并与显微镜检查结果进行比对;用E-test法进行丝状真菌药敏试验.结果 MALDI-TOF MS对100株丝状真菌鉴定达到种鉴定水平的有61株(得分≥2.000),达到属鉴定水平的有36株(1.700～1.999),未能鉴定的有3株(＜1.700);与镜检结果不一致的有1株.两性霉素B对絮状表皮癣菌的90％最低抑菌浓度(MIC90)为0.19 μg/mL,而对黄曲霉的MIC90＞32 μg/mL.伊曲康唑对断发毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的MIC90均＜0.38 μg/mL,而对黑曲霉的MIC90＞32 μg/mL.氟康唑对大部分受试菌株的MIC90均＞256μg/mL.伏立康唑和卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌、断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC90分别≤0.38μg/mL和≤1μg/mL.结论 MALDI-TOF MS技术可快速、准确、高通量检测临床分离的丝状真菌.伏立康唑和卡泊芬净对丝状真菌具有较好的抗菌活性.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)007【总页数】5页(P486-490)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;真菌药敏试验【作者】彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5近年来，由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及广谱抗菌药物的广泛应用，丝状真菌的感染比例呈上升趋势。

眼部丝状真菌感染的诊断与致病菌分离鉴定杨惠英1,索继江1,陈世平1,邢玉斌1,贾　宁1,魏　华1,宋佩茹2(1.解放军总医院,北京100853;2.北京同仁医院,北京100730)摘要:目的　分析眼部丝状真菌感染致病菌的种类和致病特征。

方法　对13例眼部丝状真菌感染患者的临床资料进行分析和致病菌分离鉴定,对眼部丝状真菌感染的致病菌、发病原因、早期诊断方法、丝状真菌与酵母菌眼部感染特征进行分析。

结果　13例患者中11例为真菌性角膜溃疡,2例为真菌性眼内炎;13例15眼标本真菌培养均为丝状真菌,其中痂病镰刀菌3例、尖孢镰刀菌2例、烟曲霉2例、谢瓦曲霉1例、黄曲霉1例、链格孢霉1例、尖端单孢子菌1例、总状毛霉1例、链霉菌1例。

结论　眼部丝状真菌感染仍以镰刀菌、曲霉为主,但有明显的多样化趋势;确定诊断须真菌检查,早期诊断是预后良好的关键。

关键词:真菌感染;分离鉴定;角膜炎;眼内炎中图分类号:R379 文献标识码:A 文章编号:100524529(2002)0520332203Fa l i m en tous Funga l I nfection i n Eyes and Pa thogen ic Fungus Iden tif ica tion YAN G H u i2ying,SU O J i2jiang,CH EN Sh i2p ing,X I N G Yu2b in,J I A N ing,W E I H ua,SON G Pei2ru(Genera l H osp ita l,PL A,B eij ing100853,Ch ina)Abstract:OBJECTIVE To find ou t the fungu s and characteristic of pathogen icity abou t filam en tou s fungal infecti on in eyes.M ETHOD S Pathogen ic fungi co llected from15eyes of13patien ts w ith filam en tou s fungal infecti on w ere iso lated fo r cu ltu ring and iden tificati on.T he patien ts clin ical data w ere analysed.Pathogen ic fungi,pathogen ic facto rs,m ethods of early diagno sis,featu re of infecti on in eyes of filam en tou s fungal and yeast w ere discu ssed.RESUL TS E leven cases of13patien ts w ere w ith filam en tou s fungal keratitis,tw o cases w ere w ith filam en tou s fungal endoph thal m itis.F ifteen speci m en s of eyes from13cases w ere po sitive w hen they had been cu ltu red in fungal lab.T he fungal species iden tified included F usa rium solan i(3cases),F.oxy sp orum(2 cases),A sp erg illus f um ig a tus(2cases),A.cheva lieri(1case),A.f lavus(1case),A lterna ria sp(1case), M onosp orium ap iosp er m um(1case),M ucor race m osus(1case),S trep ro m y ces sp(1case).CONCL USI ONSF usa rium and A sp erg illus w ere m ain pathogen ic filam en tou s fungi in eyes.sofarvbu t w ith the obvi ou s diversifiedtendency.D iagno sis has to depend on fungal exam inati on.A co rrect early diagno sis is the key fo r p roper therapy and i m p roving p rogno sis.Key words:Fali m en tou s fungu s;Infecti on;Keratitis;Endoph thal m itis 真菌性眼部感染是一种致盲率较高的眼部疾病,最常见的是角膜真菌感染(fungal keratitis, FK),其次是真菌性眼内炎,而后者较为少见。

真菌的鉴定及药敏试验分析真菌对人类健康的危害包括由病原性真菌、条件致病真菌所致的深部真菌病和浅部真菌病；由气传真菌所致的变态反应真菌症即过敏；由污染真菌产毒所致的真菌中毒症。

随着医学的发展，特别是抗生素的广泛使用，大量治疗手段的开展，免疫障碍疾病的大量发生，使真菌感染的情况日益增加，医院感染中的真菌感染也不断增加，因而，掌握真菌检验的方法就成为检验工作中的一个重要组成部分。

1 材料与方法1.1 真菌来源收集临床送检标本所分离出的真菌120例，男性84例，女性36例，其中痰液96株，粪便11例，咽拭子12例、尿液5例、血液4例，分泌物3例。

1.2 采集及处理根据真菌侵犯组织和器官的不同而采集不同的标本，而采集最合适的标本是决定能否找到病原性真菌的关键，要尽量用消毒方法采集标本以免污染。

深部真菌病的标本如血液、脑脊液、脓液、尿、痰等应及时收集检查，一般不超过1～2h，以免变质污染，标本采取前，应忌用药。

为避免污染杂菌，在收集标本时，应严格无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。

1.3 检验方法1.3.1 酵母样菌的检验直接涂片法各类标本，除脑脊液、尿、胸水、腹水等需离心沉淀后取沉淀物作涂片外，其他均可用生理盐水或10％～40％KOH作涂片后直接镜检或用革兰、墨汁、0.1％甲苯胺蓝染色后镜检。

分离酵母样菌所选用的培养基为沙保弱固体或液体培养基，在培养基中可加入各种抗生素抑制细菌的生长、有利于真菌生长含抑制剂的霉菌琼脂。

将备类标本直接接种上述培养基，除新型隐球菌需同时接种两支培养基；一支孵育于37℃，另一支孵育于22～28℃，其他酵母菌均孵育于22～28℃。

每日观察生长情况。

根据酵母菌在培养基上的菌落特征及在玉米粉吐温80培养基上生长物在显微镜下生长情况可作初步鉴定。

1.3.2 丝状真菌的检验某些丝状真菌如孢子丝菌或荚膜组织胞浆菌的直接涂片，必须染色后检查。

真菌的形态和结构通过染色更为清楚，不染色涂片不易保存，染色涂片可长期保存。

丝状真菌地鉴定主要根据形态特征。

形态特征包括群体形态和个体形态。

1、群体形态群体形态即菌落的形态。

观察菌落形态时多采用固定的培养基，将固体培养基制成平板，以点植法接种，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板上适当的位置，例如中心，或三角形的三点。

然后于25－28℃培养一定时间（如2、4、7、10天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜、低倍镜、解剖镜等。

观察的要点一般包括下列几项：1）大小：它反映生长或发育速度，通常测量菌落的直径。

2）颜色：包括菌落表面子实体、气生菌丝、菌核的颜色和基内的颜色，还应注意培养基颜色的变化。

3）菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。

4）菌落的质地：即菌落外观呈毡状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状，有无成束状或绳状的气菌丝。

5）菌落的高度：菌落扁平或凸起，中心部分凸起或凹陷。

气生菌丝的高度。

6）菌落的边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。

7）渗出物：指菌落表面有无液滴、液滴的颜色和数量。

2、个体形态个体形态指菌丝的特征，子实体的形态(如孢子囊。

子囊壳、子囊、担子果等的形态)，孢子的形态（如孢囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子、卵孢子、接合孢子、担孢子等）。

由于丝状真菌的个体大都较小，必须制成载片标本在显微镜下观察。

丝状真菌的制片比较简单，通常将乳酸苯酚（Lactophenol）液一滴，滴于载片上，再用解剖针挑取欲观察的培养物置此液滴内，并且用针尖将其分散开勿使成团，盖好盖片即得载片标本。

这种载片可保存数月，如盖片四周涂封漆则可保存数年。

1两种分生孢子, 大型分生孢子呈镰刀形，小型分生孢子呈椭圆形2孢子长方形，接连成链菌丝断裂为成串的节孢子3灰绿色，绒毛状，表面有绿色的孢子孢子圆球形，呈绿色孢子大小(μm)：3.03～4.26分生孢子梗顶端膨大，表面的产孢瓶体上成链的分生孢子。

ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌作者：吴奎海马均宝崔东岚来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第11期【摘要】目的：建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

方法：利用通用引物扩增真菌核糖体转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，在GenBank 中对测序结果进行Blastn等分析。

结果：9株真菌测序结果与表型鉴定符合，鉴定出7株临床分离丝状真菌。

结论：ITS2测序可以作为临床丝状真菌的分子生物学诊断方法之一。

【关键词】丝状真菌；内部转录间隔区；测序【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0043—02随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。

丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。

随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。

本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。

阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。

1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。

1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。

实验九丝状真菌形态特征观察生物112 周泓兆1102040226一、目的学习并掌握观察毛霉和根霉形态特征的基本方法。

二、原理毛霉和根霉都属于真菌的接合菌门。

它们是空气中最常见的污染菌。

菌落生长迅速，表面呈棉花样，初为白色，以后变灰至褐灰色。

菌丝单细胞无横隔，有分枝，多核。

毛霉无假根；根霉有假根和匍匐丝。

无性生殖产生孢囊孢子。

孢囊梗直接由菌丝体上长出，孢囊梗顶端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊轴，囊轴基部与孢囊梗连接处称为囊托。

毛霉无囊托，根霉的假根上方产生孢囊梗。

孢囊孢子呈球形、卵形或不规则形。

有性生殖形成接合孢子，常为异宗配合即由“+”“－”型菌丝接合形成。

这些结构均可通过制水压片在低倍镜下进行观察。

很多青霉、曲霉及镰刀菌尚未发现它们的有性生殖阶段，常称为半知菌。

即只知其生活周期的一半。

目前已发现有些菌的有性阶段属于子囊菌或担子菌。

这三种菌的无性生殖阶段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形态和分生孢子着生方式。

它们多是腐生菌，广泛分布于土壤、空气、水果和粮食中。

青霉菌落多为灰绿色，菌落质地绒状、絮状、绳状或束状，成熟后表面呈粉末状。

青霉菌丝可直接分化形成分生孢子梗，其顶端具有对称或不对称的扫帚状分枝，其上着生几轮小梗，小梗顶端着生成串的球状或卵状的绿色分生孢子。

曲霉菌落呈绒毛状或絮状，表面有同心圆形的轮状带。

分生孢子梗长在厚壁的足细胞上，不分枝，顶端膨大成球形、椭圆形或棍棒状顶囊。

其表面着生一层或两层小梗，下层为柱状初生小梗，上层为瓶状次生小梗，顶端着生成串的球状分生孢子。

镰刀菌菌落呈绒毛状，多为白色、粉红色或紫红色。

菌丝分隔有分枝。

具有两种分生孢子，小型分生孢子梗分枝或不分枝，其顶端有链状或假头状着生的小型分生孢子。

大型分生孢子梗不分枝，其顶端着生镰刀状大型分生孢子，多隔，单生或丛生。

载片培养法是研究丝状真菌生长繁殖全过程的有效方法。

即将菌丝体接种在载玻片上的小块培养基薄片上，加盖盖玻片，使丝状真菌只能在载玻片和盖玻片的狭窄空间内横向生长，因而可观察到孢子萌发、菌丝生长及孢子形成的各生长阶段，且不会因观察而污染标本片。