第八章发酵操作方式及发酵动力学

第⼋章发酵操作⽅式及发酵动⼒学

第⼋章发酵操作⽅式及发酵动⼒学

第⼀节发酵类型及操作⽅式

⼀、发酵的类型1、根据微⽣物对氧的需求

1）好氧性发酵

◆需不断通⼊⽆菌空⽓

◆如：利⽤⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸

利⽤棒杆菌发酵⽣产⾕氨酸

利⽤黄单胞菌⽣产黄原胶

抗⽣素发酵⽣产2）厌⽓性发酵

◆不需供氧

◆如：乳酸杆菌的乳酸发酵

梭状芽孢杆菌的丙酮丁醇发酵

酵母菌为兼性厌氧微⽣物，⽆氧时发酵⽣产酒精，有氧时发酵⽣产菌体2、按发酵培养基物理状态分

1）固体发酵

根据物料堆放的厚薄分为:

薄层发酵：⽊盘或苇帘，1～2cm，培养箱或曲室内

厚层发酵：深槽或池，架设帘，30cm以上，接种后通⽓

固体发酵优点：可直接采⽤农副产品为原料，⽣产成本和能量消耗都较低；

发酵培养基含⽔分低，有时产物浓度⼤⼤⾼于液体培养。

固体发酵缺点：

同液体发酵相⽐，固体发酵中微⽣物、营养和产物的分散，发酵热的移去和氧的供应以及杂菌污染的避免等都较困难。2）液体发酵

发酵⼯业的主要⽅法

根据培养液的深浅分表⾯培养法深层培养法

表⾯培养法（浅盘发酵）

◇利⽤浅盘，仅装⼀薄层培养液，接种后进⾏表⾯培养

◇在液体上⾯多数形成⼀层菌膜

◇在缺乏通⽓设备时，对⼀些繁殖快的好⽓性微⽣物可利⽤此法

◇早年青霉素⽣产菌株点青霉(Penicillium notatum) 具有表⾯⽣长的特点，采⽤表⾯培养⽣产青霉素

⼜如利⽤⽩地霉⽣产⼈造⾁深层发酵法

深层发酵（submerged fermentation）指在液体培养基内部（⽽不仅仅在表⾯）进⾏的培养过程。

深层发酵是当前发酵⼯业中使⽤的主要形式

液体深层发酵的优点：1）液体悬浮状态是多数微⽣物的最适⽣长环境。

2）在液体中，菌体及其底物、产物（包括热）易于扩

散，使发酵可在均质或拟均质条件下进⾏。3）液体输送⽅便，易于机械化操作。

4）⼚房⾯积⼩，⽣产效率⾼，易进⾏⾃动化控制，产品

质量稳定。5）产品易于提取、精制

⼆、发酵操作⽅式

分批操作

补料分批操作

连续操作1、分批操作分批发酵（batch fermentation）

向反应器中⼀次投⼊所需的培养基，然后接种培养，培养过程中除控制温度和pH外不进⾏其他任何控制，反应结束后将全部培养液排出进⾏处理。

缺点：

◇效率低

◇尽管微⽣物的活性和机能因其所处的环境⼤幅度变化，也根本不控制培养基组分浓度等环境因素，⽽任其⾃然变化，这样不利于⽣产。

◇在每⼀批主反应（⽣产阶段）之前，必须进⾏⼏级种⼦培养。

但由于操作相对较易，

⽬前仍是发酵⼯业的主要⽅式2、补料分批操作补料分批发酵（supplement batch fermentation）

◇介于分批培养和连续培养之间的操作⽅式；

◇在进⾏分批培养的时候，随着营养的消耗，向反应器内补充⼀种或多种营养物质，以达到延长⽣产期和控制发酵过程的⽬的。

反复补料分批培养

随着补料操作的进⾏，发酵液的体积逐渐增⼤，到了⼀定时候将部分发酵液取出，剩下的发酵液继续进⾏补料分批培养，如此可反复进⾏多次，称为反复补料分批培养。

补料分批培养应⽤：1）细胞的⾼密度培养

⼀些微⽣物能利⽤甲醇、⼄醇、⼄酸、某些芳⾹族化合物等，但它们在较⾼浓度下会对菌体的⽣产产⽣抑制。2）发⽣底物抑制的过程

◇⼀般培养基中的营养物质浓度有⼀定的限度，过⾼的底物浓度会抑制菌体的⽣长；◇采⽤补料的⽅法将⾼浓度的营养物质逐渐加⼊反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很⾼的程度，如⼤肠杆菌浓度可达145g/L。

3）分解代谢物阻遏

◇以某些很容易被微⽣物利⽤的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；

◇采⽤补料的⼿段将葡萄糖逐渐加⼊反应器中，使发酵液中的葡萄糖保持在低⽔平，避免分解代谢物的积累，从⽽可以有效去阻遏。4）营养缺陷型菌株的培养

⼀些营养缺陷型菌株可以积累某种有⽤产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利⽤这些菌株进⾏⽣产时须补充其不能合成的物质供⽣产所需；

但这些物质过量存在时，可能产⽣反馈抑制或阻遏作⽤，影响产物的合成。

采⽤补料的⽅法可将这些物质保持在低浓度⽔平，有助于提⾼产物的⽣产。5）前体的补充

◇在⼀些发酵过程中，加⼊前体可使产物的⽣产⼤⼤增加；

◇但许多前体对菌体有毒性；

◇通过补料加⼊前体既满⾜产物合成的需要，⼜不使前体⼤量积累⽽产⽣抑制作⽤。

补料⽅式：

间歇添加法

间歇添加营养物质后，其在发酵液中的浓度即会上升，然后随着微⽣物的利⽤⼜下降；再次补⼊料液后，营养物质浓度再次升⾼，然后再次下降，呈现较⼤的波动。

连续流加法

恒速流加(constant-flow rate)

◇恒速流加操作的补料速度是定值，操作简便，设备简单；最常⽤；

◇发酵液体积呈线性增长；由于在指数⽣长期，微⽣物的底物消耗也呈指数增加，恒速流加不能维持底物浓度不变，底物浓度会随时间延长⽽逐渐降低。

指数流加(exponential-flow rate)

◇指数流加补料的加⼊量呈指数规律增长，能在短时间内得到最⼤量细胞，还可通过变更流率指数来控制⽐⽣长速率；

◇但装置相当复杂

3、连续操作连续发酵（continuous fermentation）

连续不断地补加新鲜培养基，连续不断地排出培养物

连续培养的类型：

⑴据设备类型⑵据控制⽅法

罐式连续培养恒化连续培养

恒浊连续培养管式连续培养

⑶据菌种⑶据级数

循环式连续培养单级连续培养

多级连续培养⾮循环式连续培养

◇经连续培养后，流出的培养液进⾏固液分离，经浓缩后的细胞悬浮液再被送回发酵罐；◇也称为细胞回流连续培养；◇相当于不断进⾏接种，可以提⾼发酵罐中的细胞浓度，也有利于提⾼连续培养系统的操作稳定性。

◇多级连续培养特别适⽤于细胞⽣长和产物合成的最佳条件不同的情况。

例如⽤葡萄糖-半乳糖培养基培养Monascus⽣产 -半乳糖苷酶时，葡萄糖有利于菌体的⽣长，⽽酶的⽣产则受半乳糖的诱导，但葡萄糖⼜对半乳糖的利⽤产⽣阻遏作⽤。根据这⼀特点，靠考虑采⽤⼆级连续培养。第⼀级⽤葡萄糖作为碳源，以获得⼤量菌体，第⼆级加⼊半乳糖，促进酶的⽣产。

◇多个发酵罐串联起来，前⼀罐的出料作为下⼀罐的进料；

◇多级串联可以提⾼⽣产能⼒

连续培养的优点：1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提⾼设备的利⽤率和单位

时间产量。2）发酵中各参数趋于恒值，便于⾃动控制；

3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。

连续培养存在的问题：1）菌种的变异

2）实际运⾏时间

连续发酵对设备的密封性、培养液和空⽓的⽆菌度要求严格，⽬前使⽤的空⽓过滤器不能完全保证（长时间）100%的除菌效率3）反应器传质能⼒

4）丝状菌丝的阻塞

加⼊连续发酵罐的培养基与罐内发酵液的混合不均匀，即均匀度不够，就会使罐内各部分的微⽣物⽣长不⼀致，某部分微⽣物得不到充分的营养⽽引起操作不确定并降低产率。对于⾼黏度发酵液均匀度不够的情况更为严重。

连续培养的应⽤：1）细胞的⽣产如单细胞蛋⽩的⽣产

2）代谢产物的⽣产

已在⼯业上采⽤连续培养的有啤酒、丙酮-丁醇等的⽣产；

不同操作⽅式菌体及底物浓度随时间变化的情况

第⼆节数学模型

◇发酵动⼒学是以化学热⼒学（研究反应的⽅向）和化学动⼒学（研究反应的速度）为基础，对发酵过程各种物质的变化进⾏描述。

◇研究内容包括了解发酵过程中菌体⽣长速率、基质消耗速率和产物⽣产速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速率的条件。

◇研究的重要⽅法是建⽴数学模型定量地描述发酵过程中细胞⽣长速率、基质利⽤速率和产物⽣成速率等因素的变化。

◇研究的最终⽬的是对发酵过程进⾏有效控制，从⽽提⾼产品的产率及降低⽣产成本。

⼀、动⼒学模型的分类

◆微⽣物⽣理学家和⽣化⼯程学家提出了许多模型，有些是经验模型，也有些是机理模型。

◆这些模型可分为概率论模型和决定论模型两⼤类

微⽣物反应动⼒学模型的分类模型类型着眼点说明A概率论模型微⽣物个体概率论模型须考虑每个细胞的差异来说明某⼀特

定现象，或⽤以说明平均值附近的波动情况。B决定论模型微⽣物群体决定论模型不考虑每个细胞的差异，⽽是取菌体

性质及数量的平均值进⾏数学处理。B-1a 均相模型微⽣物群体是⼀种认为菌体均匀分散于培养液中，可作为均

相处理的决定论模型B-1b⽣物相分离模型微⽣物群体是将菌体作为与培养液（连续相）分离的⽣物相

处理所建⽴的决定论模型。这种模型需说明培养

液与菌体间的物质传递及分配效应。B-2a 结构模型微⽣物群体考虑菌体组成的变化，将活菌体和死菌体分别处

理。均相模型和⽣物相分离模型均可分别构成结构

模型。B-2b ⾮结构模型微⽣物群体这种模型与结构模型的主要区别在于它不考虑细

胞组成的变化

⼆、建⽴数学模型的⼀般原则1）明确建⽴模型的⽬的。

2）明确建⽴模型的假设，从⽽明确模型的适⽤范围。

3）模型中所含的参数，最好能分别通过实验测定。

4）模型应尽量简单。

据此，决定论模型的均相模型最合适，使⽤⽅便。

除为了深⼊研究微⽣物⽣长这⼀复杂现象外，多数是为了设计微⽣物反应器、探索最优操作条件，或者对反应过程进⾏最优控制

第三节微⽣物的⽣长速率

⼀、⽐⽣长速率

◆均衡⽣长

随着细胞质量的增加，细胞内所有可检测的菌体组成物质，如蛋⽩质、DNA、RNA 等以相同⽐例增加。

◆⾮均衡⽣长

类似储存物质的积蓄过程及分批培养初期细胞组成物质的⾮均衡快速合成情况等则属于⾮均衡⽣长。

均衡⽣长类似于⼀级⾃催化反应，以菌体⼲重的增加为基准的⽣长速率，即单位体积培养液中单位时间内⽣成菌体的⼲重与菌体浓度成正⽐。rx = µX 或 µ = rx / X

式中的⽐例系数 µ 称为⽐⽣长速率——相对单位质量⼲菌体单位时间内增加的⼲菌体质量;（g / g · h ）

◇ ⽣物种的遗传基因是决定⽐⽣长速率⼤⼩的决定因素。

细胞包含的遗传信息越复杂，细胞越⼤，即越是⾼等⽣物， µ越⼩。