下载文档原格式
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在两个方向上进行电泳分离的技术，通常用于核酸和蛋白质的分析。
在进行这种电泳过程中，可能会遇到一些问题。
以下是一些常见问题及其可能的解决方法：
1.电泳带模糊或不清晰：
-可能原因：
-样品质量不纯。
-缓冲液配制有问题。
-电场均匀性差。
-解决方法：
-使用纯净的、高质量的核酸或蛋白质样品。
-重新配置新鲜的缓冲液。
-检查电场均匀性，确保电场平均分布。
2.电泳速度过快或过慢：
-可能原因：
-电流设置不当。
-缓冲液浓度不正确。
-解决方法：
-调整电流，确保在设备规定的范围内。
-检查并重新配置适当浓度的缓冲液。
3.电泳带变形或扭曲：
-可能原因：
-样品加载不均匀。
-凝胶浓度选择不当。
-解决方法：
-确保样品加载均匀，使用适当的体积和加载方法。
-重新制备适当浓度的凝胶。
4.电泳凝胶干燥或开裂：
-可能原因：
-凝胶聚合物浓度太高。
-电泳室湿度不足。
-解决方法：
-降低凝胶聚合物的浓度。
-提高电泳室的湿度，可以考虑使用湿度控制设备。
5.样品负载量过多或过少：
-可能原因：
-样品量测量错误。
-样品浓度过低。
-解决方法：
-确保准确测量样品量。
-调整样品的浓度，确保在电泳中可以产生明显的带。
在实验过程中，及时记录实验条件和参数，有助于更容易地识别和解决问题。
如果问题持续存在，建议向实验室同事、导师或相关领域的专家寻求帮助。
收稿日期:2009-02－28品种纯度在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值，纯度的高低在农业生产中对作物产量和品质都有很大影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为种子纯度检验方法之一，与田间纯度检验和田间小区种植鉴定相比具有方法简单易行、省时快速、成本低廉、测定准确等优点，但在使用过程中，经常会遇到一些故障或问题，影响实验的正常进行，甚至会严重影响鉴定结果，笔者经过多年实践，对其总结、分析和研究，现以杂交玉米种子纯度鉴定为例，归纳如下：1谱带不清晰或特征谱带不明显原因1.1凝胶贮备液、样品提取液失效配制好的贮备液、提取液在4℃条件下贮存20d 效果较好，时间太长有些药品会失效。
1.2磨样时，样本颗粒掺混样本掺混时，两个样本的特征同时被表现，谱带难以辨认。
要注意磨完样后擦净磨样器，使用的承样纸也要每次更换一张。
1.3样品提取时间太短要求加样品提取液后摇匀，5min 后再摇一次，30min 后，用离心机（5000r/min ）离心15min ，取上清液电泳。
1.4点样时发生漂移在点样时由于人为蹿位或样品梳间凝胶被破坏，样液自然漂移造成特征谱带重合，注意在插取梳子时，时间要恰当，用力要均匀，点样时要专心认真。
1.5电压太低品种不同，要求不同电压，电压太低时谱带走不开即迁移率（Rf ）差别不太大，特征区不明显。
1.6电泳超时电泳时间过长，能够表现品种特征的蛋白质谱带泳到下部或缓冲液中，则不能观察谱带特征。
要注意观察甲基绿批示线下到离玻璃板1cm 即可停止电泳。
1.7染色液陈旧，染色时间太短由于多次染色胶面带水使染色液浓度降低或考马斯亮蓝沉积而影响染色效果。
要经常更换染色液或再添加少许染料乙醇溶液。
一般染色在30℃条件下进行2～4h 。
1.8某些药品实际成分不足如三氯乙酸吸水，染色有效成分降低，染色效果欠佳。
注意三氯乙酸和考马斯亮蓝的有效成分，必要时须更新。
1.9电泳时室温太高室温太高，使用某些药品成分发生变化，致使谱带不清晰。
聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定小麦种子纯度及常见问题处理
肖杰;李思云
【期刊名称】《信阳农业高等专科学校学报》
【年(卷),期】1999(000)001
【摘要】本文主要论述了聚丙烯胶胺凝胶电泳鉴定小麦种子纯度的原理和方法，并对测定过程中常见问题的处理措施作了简要介绍
【总页数】3页(P91-93)
【作者】肖杰;李思云
【作者单位】信阳市种子管理站!信阳464000
【正文语种】中文
【中图分类】S339.3
【相关文献】
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法 [J], 丁向荣;赵玉平
2.琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶电泳在SSR鉴定杂交油菜种子纯度中的比较 [J], 王爱娜;王灏;李殿荣;田建华;赵亚军;李保军;罗斌;赵卫国;王晓东
3.利用种子蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定玉米种子纯度的研究 [J], 严莉;谢英维;颜彤;刘炜;张亚平
4.利用种子蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定新葵6号种子纯度 [J], 段维;谢宗铭;陈福隆;陈寅初;李万云;张力
5.利用种子蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定向日葵种子纯度的研究 [J], 段维;谢宗铭;陈福隆;陈寅初;李万云
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
收稿日期:2009-02－28品种纯度在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值，纯度的高低在农业生产中对作物产量和品质都有很大影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为种子纯度检验方法之一，与田间纯度检验和田间小区种植鉴定相比具有方法简单易行、省时快速、成本低廉、测定准确等优点，但在使用过程中，经常会遇到一些故障或问题，影响实验的正常进行，甚至会严重影响鉴定结果，笔者经过多年实践，对其总结、分析和研究，现以杂交玉米种子纯度鉴定为例，归纳如下：1谱带不清晰或特征谱带不明显原因1.1凝胶贮备液、样品提取液失效配制好的贮备液、提取液在4℃条件下贮存20d 效果较好，时间太长有些药品会失效。
1.2磨样时，样本颗粒掺混样本掺混时，两个样本的特征同时被表现，谱带难以辨认。
要注意磨完样后擦净磨样器，使用的承样纸也要每次更换一张。
1.3样品提取时间太短要求加样品提取液后摇匀，5min 后再摇一次，30min 后，用离心机（5000r/min ）离心15min ，取上清液电泳。
1.4点样时发生漂移在点样时由于人为蹿位或样品梳间凝胶被破坏，样液自然漂移造成特征谱带重合，注意在插取梳子时，时间要恰当，用力要均匀，点样时要专心认真。
1.5电压太低品种不同，要求不同电压，电压太低时谱带走不开即迁移率（Rf ）差别不太大，特征区不明显。
1.6电泳超时电泳时间过长，能够表现品种特征的蛋白质谱带泳到下部或缓冲液中，则不能观察谱带特征。
要注意观察甲基绿批示线下到离玻璃板1cm 即可停止电泳。
1.7染色液陈旧，染色时间太短由于多次染色胶面带水使染色液浓度降低或考马斯亮蓝沉积而影响染色效果。
要经常更换染色液或再添加少许染料乙醇溶液。
一般染色在30℃条件下进行2～4h 。
1.8某些药品实际成分不足如三氯乙酸吸水，染色有效成分降低，染色效果欠佳。
注意三氯乙酸和考马斯亮蓝的有效成分，必要时须更新。
1.9电泳时室温太高室温太高，使用某些药品成分发生变化，致使谱带不清晰。
在冰箱中进行电泳效果最好。
1.10用加酶洗衣粉冲洗胶面洗衣粉中的酶具有增白的作用会冲去胶板的蓝色，而影响谱带的清晰度，注意要使用不加酶的洗衣粉。
2谱带不整齐2.1玻璃板不干净玻璃板有污点，凝胶与玻璃黏合不紧密，电泳时蛋白质迁移速度不一致。
制板前将玻璃板洗净、晒干。
2.2药液比例不适当或未摇匀由于称量、定容、取液时不准确或操作误差改变了凝胶浓度，影响了成胶速度及胶的硬度，导致凝胶孔径最终影响蛋白质在凝胶中的电泳速度。
注意要准确称量、规范操作。
2.3分离胶、浓缩胶中有气泡胶板中有气泡，当蛋白质电泳到气泡时会停止或发生偏向下移，导致谱带不整齐。
在灌液时，要使电泳槽稍微倾斜，避免产生气泡，发现气泡立即用钢丝挑出。
2.4分离胶不整齐分离胶不整齐会直接影响蛋白质相对迁移距离，造成谱带高低不平。
在灌入分离胶后用手振荡一下电泳槽，振平胶面，迅速用正丁醇封住胶面。
水封时注意不要冲坏胶面。
用滤纸吸水时，不能接触胶面。
3谱带颜色深浅不一致3.1种子成熟度不一致成熟度越好，盐溶蛋白质含量越高，谱带越清晰，否则，颜色浅一些，在分析谱带时要注意这一点，不能因色浅而误断。
3.2点样时用量不一致因样品提取液与样品量比例不符或点样器原因或人为操作原因造成样品有效量不一致。
这种误差难以完全消除，只能通过各种途径控制减少误差。
3.3磨样时包含重要特征的部位丢失如玉米种子的胚部丢失，含有特征的盐溶蛋白质不能表现在谱带上，谱带无色或颜色较浅。
所以在磨样时要注意将样品完全收集，特别是种子水分较高时种子胚部容易粘在磨子上，可在40℃下烘干1～2h 。
3.4染色时胶板重叠染色时因染色液少或胶板多会造成胶板部分重叠，重叠部分着色浅。
染色时染色液量要大，或使用多个染色槽。
4谱带拖尾4.1电极缓冲液失效电极缓冲液存放时间过长或使用次数太多，引起蛋白质谱聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法丁向荣，赵玉平(乌兰察布市种子管理站，内蒙古集宁012000)中图分类号:Q814文献标识码:C 文章编号:1007-0907(2009)02-0076-01（下转85页）内蒙古农业科技2009（2）：76Inner Mongolia Agricultural Science And Technology带扩散。
电极缓冲液最好是现用现配，使用最多不超过4次。
4.2分离胶面不平分离胶面不平，出现倾斜度，则会造成蛋白质谱带出现拖尾现象。
灌胶后要迅速振荡、放置水平。
4.3电压太高当电压太高时，电泳速度加快，蛋白质分离效果差，出现拖尾现象。
一定要根据品种选择适当的电压电泳，不可急于求成。
5电泳不跑电泳不跑，主要电路没有接通，有以下原因：①电极接反；②电泳仪接线盒插头没插好；③电极缓冲液不够；④电泳仪保险丝断裂；⑤电泳槽铂丝断裂，要逐项检查电路，排除故障。
6其他故障6.1胶板容易龟裂一是因为玻璃板陈旧发生粘板，要及时更换玻璃板；二是药品比例不当，凝胶太硬或太软，缺乏韧性。
在操作时，要严格按照比例，定量操作。
6.2胶面不齐在振荡无效时，则是因为催化剂（AP）量太大，凝结速度太快，要减少AP用量，使凝胶时间控制在15min左右。
参考文献:[1]黄象男，任建升，郑祥艳，等.盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验报告[J].现代农业科技,2007,(15):102-103.（责任编辑敦惠霞）除饲料中抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率。
植酸磷会与饲料中的蛋白质、钙、锰、铁等无机元素和维生素等螯合，使它们不被利用。
植酸酶可分解植酸磷，解除螯合，营养物质利用率得以提高；（4）降低动物粪便中磷的含量，减轻对环境的污染。
动物粪便中的粪泄入水源会造成水的磷富化，植酸酶的应用可以大大缓解污染程度，减少量达25％～65%；（5）提高蛋白质和氨基酸消化率。
植酸可以络合蛋白质，抑制消化道蛋白水解酶的活性。
日粮中添加植酸酶就可以分解被植酸络合的蛋白质和氨基酸，并终止植酸对其他消化酶的抑制作用，从而促进氮的消化和吸收；（6）提高动物的消化机能。
悉尼大学的肉仔鸡实验中，在小麦-高粱-米糠-豆粕日粮中添加植酸酶，日粮表现代谢能提高了9%。
可见，日粮中添加微生物植酸酶不仅可以促进磷的吸收，还可以提高钙、锌、蛋白质和氨基酸的利用率。
饲料工业对微生物植酸酶的认识和接受，不仅取决于它的作用效果，还决定于植酸酶的价格、产品稳定性和易操作性。
植酸酶能否取得和添加无机磷一样的经济效益，决定于植酸酶的额外效应，特别是可促进蛋白质和氨基酸的利用方面，如果在综合评定时考虑后两个因素，植酸酶的经济效益将更明显。
因此，植酸酶作为一种日益广泛使用于饲料工业中的绿色添加剂，饲喂效果已在世界范围内得到了确证。
在猪、禽等单胃动物日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高，畜禽粪便中磷的排出量减少。
它还可降解植酸盐的抗营养作用，所以，使用植酸酶促进营养物质的利用，降低磷排出，减少环境污染的潜力是巨大的。
因此，在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
参考文献：[1]于炎湖.植酸的抗营养作用及植酸酶在饲料中的应用[J].粮食与饲料工业，1999,(2):25－27.[2]黄遵锡，章克昌.植酸酶基础与应用研究概况[J].食品与发酵工业,1999,25(2):54－58.[3]程海娜，莫湘涛，陈宇，等.植酸酶分子结构与功能研究进展[J].生物技术，2003,16(3)：20－22.[4]红宁，吴琦，谢晶，等.真菌植酸酶phyA基因研究进展[J].四川农业大学学报，2000,18(1):84-87.[5]刘生峰，彭远义.植酸酶基因工程研究进展[J].生命科学研究，2003,7(2):30-33.[6]吴静,闰艳春.植酸酶基因工程的研究进展[J].中国畜牧兽医,2004.31(1):12-15.[7]李弘剑，陈震球，张毅，等.工程菌JM-109-pTrcHis2A phyA表达植酸酶的研究[J].暨南大学学报(自然科学版)，2001,22(5):102-106.[8]姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus.subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].生物工程学报，2001,17(1): 12-15.[9]姚斌，张春义，王建华，等.高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母[J].中国科学(C辑),1998,28(3):237-243.[10]Nagashima T,tange T,Anazwa H.Dephosphorytation of phytate usingAspergillus niger phytase with a high affinity for phytate[J].Environ Microbiol,1999,(10):4682-4684.[11]Ravindran V,Bryden W L,Komegay E T,et al.Phytase:occurrence,bioavailabity and implications in poultry nutrition[J].Pig and Avian Biology Reviews,1995,(6):125-143.[12]Wyss M,Paamontes L,Friedlein A,et al.Biophysical characterizationof fungal phytase:molecular size，glycosylation patern and engineering of proteoly tic resistance[J].PI Appl Environ Microbiol, 1999,65(2):359-366.[13]Wyss M,Brugger,Kroenberger A.Biochemical characterization Offungal phytase(myoinositol hexakis phosphate phosphohydrolase): catalytic properties[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(2):367-373.[14]Rodriguez E,Mullaney E J,Lei et al.pression of the Aspergillusfumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J].Biochem Biophys ResCommun,2000,268(2):373-378.[15]MullaneyE J,Daly C B,Sethumad havan K,et al.Phytase activity inAspergillus fumigatus isolates[J].Biochem Biophys ResCommun, 2000,275(3):759-763.[16]Barfientos L,Scot J J,Murthy PPN.Specificity of hydrolysis of phyAacid by alkaline phytase from lily pollen[J].Plant Physicol,1994, (106):1489-1495.[17]Greiner R,A mingerM L,Carlsson N G.Stereo Specificity ofmyoinositol hexakis phosphate dephosphorylation by a phytate-degrading enzyme of baker's yeast[J].J Agric Food Chem,2001,49(5): 2228-2233.[18]Verwoerd T C,Paridon P A,Van.Stable accumulation of Aspergillusniger phytase in transgenic tobaccole aves[J].Plant Physicol,1995, (109):1199-1205.[19]UllahA H,Sethum adhavan K,Mullaney E J,et al.Cloned andexpressed fungal phyA gene intal Produce stable phytase[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(4):1343-1348.（责任编辑吴云霞）(上接76页)2期关巍等：植酸酶基因研究及应用前景展望85。
