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工业技术科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald126咖啡因：(Caf fei ne)是咖啡果中含有的一种生物碱，适度使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重，但由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因就不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致吸食者下一代智能低下，肢体畸形。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因主要用于对抗中枢抑制状态，如严重传染病、镇静催眠药过量引起的昏睡及呼吸循环抑制等，可肌肉注射苯甲酸钠咖啡因。
此外，咖啡因还常配伍麦角胺治疗偏头痛：配伍解热镇痛药治疗一般性头痛[1]。
此时，它由于收缩脑血管，减少脑血管搏动的幅度而加强以上药物止头痛的作用。
目前对于咖啡因测定的方法主要有：滴定法[2]、紫外可见分光光度计法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]、薄层色谱法[6]、毛细管电泳法[7]等方法。
文章采用高效液相色谱的方法测定咖啡因，建立了采用高效液相色谱的方法测定云南小粒咖啡豆中咖啡因的方法，试验表明该方法前处理简单，分离效能好，回收率高，可以快速、简便、准确地检测云南小粒咖啡豆中的咖啡因，得到准确的检测结果。
1 材料与方法1.1 试验材料云南小粒咖啡豆（市售）；超纯水；氧化镁（M g O）；甲醇（CH 3OH）：色谱纯；咖啡因标准品（C 8H 10N 4O 2）：纯度≥99%；编号：58-08-2；批号：200911；生产厂家：美国。
高效液相色谱仪（带紫外检测器，A g i le nt 1260美国安捷伦科技有限公司）；水浴锅（HH-6常州国华有限公司）；电子天平（CP213美国,奥豪斯），感量为0.1 m g；超纯水器（明澈UV24美国密理博公司）。
一.实验步骤1. 精密配制含咖啡因浓度为约1mg·mL-1的咖啡因甲醇溶液。
2.. 将上述溶液用甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg·mL-1等5份对照品溶液。
3. 根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析。
4.待仪器稳定后，按标准溶液浓度递增的顺序，由稀到浓依次等体积进样5微升（每个标样重复进样3次），准确记录各自的保留时间。
4. 同样取5微升待测饮料试液进色谱分析（重复3次），准确记录各个组分的保留时间。
5. 根据标准物的保留时间确定饮料中的咖啡因组分峰。
6. 计算系列咖啡因标准物和待测咖啡因的峰面积（3次平均值）。
7. 以标准物的峰面积对相应浓度做工作曲线。
8. 从工作曲线上求得饮料中咖啡因的浓度。
9.实验完成后，按要求关好仪器。
二.实验数据处理1.记录实验条件2.处理色谱数据，将系列对照品溶液与饮料试样的咖啡因色谱峰保留时间及峰面积列于下表中●绘制咖啡因色谱峰面积-对照品溶液浓度的回归曲线，并计算回归方程和相关系数。
●根据试样中咖啡因色谱峰面积值，计算试样中的咖啡因浓度。
流动相的选择： 1.以水为溶剂，0.03mol\L醋酸铵溶液—甲醇为流动相2．甲醇一水作流动相3.甲醇+0．04mol／L乙酸钠缓冲液(55+45)；分别来考察分析物的洗脱分离情况，流动相为甲醇水溶液20%甲醇+ 80%二次蒸馏水在上述色谱条件下，本实验分别选择了3种不同的流动相：甲醇－水（30∶70）、乙腈－水（12∶88）、甲醇－乙腈－水（10∶10∶80）。
结果表明使用3种不同流动相对照品分离均较好，考虑到甲醇较乙腈廉价，选择甲醇－水（30∶70）作为流动相。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
云南小粒咖啡中咖啡因含量比较分析张绍龙;邱碧丽;刘超;代丽玲;杨廷彬;段丽娜【期刊名称】《云南化工》【年(卷),期】2018(045)007【摘要】目的:全面了解不同产区、不同海拔咖啡生豆和焙炒咖啡豆中咖啡因含量变化规律.方法:采集保山市、临沧市、普洱市三大产区的咖啡生豆,取其二分之一进行中等烘焙,采用高效液相色谱法进行咖啡因含量测定.结果:三大产区咖啡生豆中咖啡因平均含量:保山市为1.123％,临沧市为1.040％,普洱市为:0.983％;焙炒豆咖啡因平均含量:保山市为1.211％,临沧市为1.196％,普洱市为1.150％.高海拔区,咖啡生豆及焙炒豆咖啡因含量分别为1.159％、1.275％,是低海拔区的1.215、1.175倍.结论:三大咖啡产区咖啡因含量从高到低依次为保山市、临沧市、普洱市,焙炒咖啡豆中咖啡因含量高于生豆咖啡因含量,同时,咖啡因的含量随着海拔的升高而增高,这可为提高云南咖啡品质和产业发展提供科学依据和参考.【总页数】3页(P79-81)【作者】张绍龙;邱碧丽;刘超;代丽玲;杨廷彬;段丽娜【作者单位】保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000;保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000;保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000;保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000;保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000;保山市质量技术监督综合检测中心云南保山 678000【正文语种】中文【中图分类】TS272【相关文献】1.班玛藏茶与云南普洱茶中咖啡因含量对比分析 [J], 尕土才让;才让措;娘毛加;王宁芳2.咖啡及咖啡制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量比较分析 [J], 邵金良;刘兴勇;杨东顺;樊建麟;杜丽娟;王丽;汪禄样3.超临界流体萃取法脱除云南小粒咖啡豆中咖啡因的研究及评香模型初建 [J], 刘锦耀;赵建平;张先俊4.高效液相色谱法测定云南小粒咖啡豆中咖啡因的含量 [J], 陈娴;刁玉华;肖丽恒5.HPLC法同时测定云南小粒咖啡中4种成分的含量 [J], 邱碧丽;代丽玲;刘超;张绍龙;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。
咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。
二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。
2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。
对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。
实验一、高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量一、实验目的：1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；2、掌握高效液相色谱仪的操作；3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；4、掌握标准曲线定量法。
二、实验原理：咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，分子量为结构式： N NN N CH 3CH 3CH 3OO用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。
在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂1、仪器Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱（C 18）：4.6mm ×150mm ）粒径5μm ；平头微量进样器：10μl2、试剂：① 咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶装）、雀巢咖啡② 1000μg/mL 咖啡因储备液：将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g 咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，待用。
四、实验内容：1、色谱条件：柱温：室温； 流动相：甲醇／水＝60：40流量：1.0mL/min 检测波长：275nm2、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取1000μg/mL 咖啡因储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于5只50mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL3、样品前处理：①将25mL 可口可乐置于100mL 烧杯中，剧烈搅拌30min 或用超声波脱气5min ，以赶净二氧化碳。
超高效液相色谱法快速测定食品中的咖啡因研究摘要采用超高效液相色谱测定食品中的咖啡因,采用ACQUITY UPLC?誖BEH C18色谱柱分离,以甲醇-水溶液为流动相进行洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为272 nm。
结果表明,咖啡因与其他杂质均能达到基线分离,咖啡因的浓度在2～200 mg/L时与峰面积成良好的线性关系。
回收率为95.0%～99.1%,精密度测试结果的RSD为1.02%。
该方法简便、准确、快速、重现性好、回收率高,适用于食品中咖啡因的测定。
关键词超高效液相色谱;食品;咖啡因;测定SimultaneousDeterminationofCaffeineinFoodbyUltraPerformanceLiquidChroma tographyXIAO HanLIANG WeiZHOU BoTAO Jian(Henan Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Zhengzhou Henan 450004)AbstractUltra performance liquid chromatography(UPLC)was used for the simultaneous determination of caffeine in food.Chromatographic separation was performed on ACQUITY UPLC?誖BEH C18 column.The mobile phase was a mixture of methanol and deionized water at a flow rate of 0.4 mL/min and the column temperature was 30℃.The UV detection wavelength was fixed at 272 nm.Results showed that caffeine and other compounds were separated well and the standard curve of caffeine had good linearity in the concentration range of 2~200 mg/L.The recovery rate was 95.0%～99.1%.The RSD was 1.02%.This method was proved to be simple,accurate,rapid with good reproducibility and high recovery rate.It was suitable for the determination of caffeine in food.Key wordsultra performance liquid chromatography(UPLC); food;caffeine;determination咖啡因又称咖啡碱,白色粉末或六角棱柱状结晶,属于甲基黄嘌呤的生物碱,化学名是1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7-三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮,溶于水、乙醇、氯仿等溶剂。
高效液相色谱法测定云南小粒咖啡豆中咖啡因的含量
作者：陈娴刁玉华肖丽恒
来源：《科技创新导报》2017年第19期
摘要：建立测定云南小粒咖啡豆中咖啡因含量的HPLC方法，采用高效液相色谱仪带紫外检测器，使用C18柱（粒径：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流动相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测器波长272 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μL作为分析条件。
咖啡因在0～200 ug/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；回收率均在90%～110%之间；检出限为0.125 mg/kg。
结论该法具有准确、灵敏、重复性好等优点，适合饮料中的咖啡因含量的检测。
关键词：液相色谱法测定云南小粒咖啡豆咖啡因
中图分类号：O652.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）07（a）-0126-02
咖啡因：（Caffeine）是咖啡果中含有的一种生物碱，适度使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重，但由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因就不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致吸食者下一代智能低下，肢体畸形。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因主要用于对抗中枢抑制状态，如严重传染病、镇静催眠药过量引起的昏睡及呼吸循环抑制等，可肌肉注射苯甲酸钠咖啡因。
此外，咖啡因还常配伍麦角胺治疗偏头痛：配伍解热镇痛药治疗一般性头痛[1]。
此时，它由于收缩脑血管，减少脑血管搏动的幅度而加强以上药物止头痛的作用。
目前对于咖啡因测定的方法主要有：滴定法[2]、紫外可见分光光度计法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]、薄层色谱法[6]、毛细管电泳法[7]等方法。
文章采用高效液相色谱的方法测定咖啡因，建立了采用高效液相色谱的方法测定云南小粒咖啡豆中咖啡因的方法，试验表明该方法前处理简单，分离效能好，回收率高，可以快速、简便、准确地检测云南小粒咖啡豆中的咖啡因，得到准确的检测结果。
1 材料与方法
1.1 试验材料
云南小粒咖啡豆（市售）；超纯水；氧化镁（MgO）；甲醇（CH3OH）：色谱纯；咖啡因标准品（C8H10N4O2）：纯度≥99%；编号：58-08-2；批号：200911；生产厂家：美国。
高效液相色谱仪（带紫外检测器，Agilent 1260美国安捷伦科技有限公司）；水浴锅（HH-6常州国华有限公司）；电子天平（CP213美国，奥豪斯），感量为0.1 mg；超纯水器（明澈UV24美国密理博公司）。
1.2 试验方法
称取1 g（精确至0.001 g）经粉碎低于30目的均匀样品于250 mL锥形瓶中，加入约200 mL水，沸水浴30 min，不时振摇，取出流水冷却1 min，加入5 g氧化镁，振摇，再放入沸水浴20 min，取出锥形瓶，冷却至室温，转移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度（使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。
1.2.1 标准曲线的绘制
咖啡因标准储备液（2.0 mg/mL）：准确称取咖啡因标准品0.002008 g（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。
放置于4 ℃冰箱，有效期为6个月。
咖啡因标准中间液（200 μg/mL）：准确吸取5.0 mL咖啡因标准储备液于50 mL容量瓶中，用水定容。
放置于4 ℃冰箱，有效期为一个月。
咖啡因校准曲线工作液：吸取咖啡因标准中间液，配制成浓度分别为10.0、20.0、40.0、80.0、100、120.0、160.0、200 μg/mL的工作液，临用时配制。
将标准系列工作液经液相色谱仪测定，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.2 仪器工作条件
色谱柱：C18柱（粒径：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流动相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测器波长272 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μL。
2 结果与分析
2.1 校准曲线
取咖啡因标准溶液，用高效液相色谱仪自动进样，标准曲线方程为
y=27.32252x+12.55479，r=0.99985（见表1），表明线性关系良好。
2.2 精密度试验
取咖啡因含量高、中、低3个浓度分别进行6次测定，计算6次结果的相对标准偏差，变异系数均小于15%（见表2），表明使用该方法测定咖啡因数据可靠。
2.3 检出限
方法的测定限为信噪比（S/N）3∶1时的浓度，计算得到方法检出限为：0.000 5 μg/mL，即：0.125 mg/kg。
定量限为信噪比（S/N）10∶1时的浓度为：0.42 mg/kg。
标样色谱图如图1，样品色谱图。
2.4 回收率和误差
精确称取1.0 g云南小粒咖啡豆样品，加入标样，浓度为20.28 μg/mL，进行3次测定，经测定后平均值117.634 4 mg/kg，误差为3.6，回收率为97%（见表3）。
偏差范围小，说明该
方法的准确度较好。
3 结语
试验结果表明，采用建立的高效液相色谱检测方法测定云南小粒咖啡豆中的咖啡因，具有准确、快速、简便的优点，且测量的范围满足标准限量的检测要求。
参考文献
[1] 董善士，王义明，林似兰，等.维磷补汁中咖啡因的HPLC分析条件的单纯形法优化[J].中国科技大学学报，1987， 18（3）：209.
[2] 张帆，贺学峰，汪学楷.高效液相色谱法测定饮料中食品添加剂的含量[J].四川大学学报：工程科学版，2000，34 （4）：56-58.
[3] 沈其元.高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因[J].环境与职业医学，2002，19（5）：329.
[4] 赵清岚，杨静，白冰，等.薄层扫描法同时测定绿茶中的EGCG、ECG和咖啡因[J].河
南大学学报：自然科学版，2009，39（3）：256-258.
[5] Tasker R A R，Connell B J，Strain S M.Pharmacology of systematically administered domoic acid in mice[J].Can J Physiol pharmacol，1991，69（3）：378-382.
[6] Smith D S，Kitts D D.Enzyme Immunoassay for the determination of domoic acid in mussel extracts[J].J Agric Food.Chem，1995（43）：367-371.
[7] Garthwaite I，Ross K M，Miles C O，et al.Polyclonal antibodies to domoic acid and their use in immunoassays for domoic acid in seawater and shellfish[J].Nat Toxins，1998（6）：93-104.。
