SDS-PAGE电泳标准操作规程(SOP)rosoft Office Word 文档

SDS-PAGE电泳标准操作规程(SOP)一．仪器装置1．电泳仪2．夹心式垂直电泳槽3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm4．可调微量移液器5．微量进样器6．转移脱色摇床二．试剂配制1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。

每隔2个月重新配制。

小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。

如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。

2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。

3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。

4．10% 十二烷基硫酸钠溶液用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。

5．10% 过硫酸铵溶液用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。

6．四甲基乙二胺（TEMED）液7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml，混匀，加去离子水定容至100ml，室温保存。

8．1% 溴酚兰指示液用天平称取1.0g溴酚兰（BPB），加0.05M NaOH溶液3ml使溶解，用去离子水定容至100ml。

9．2X样品缓冲液（0.125M Tris-HCl，pH6.8，4% SDS，20% 甘油，10% 巯基乙醇）取浓缩胶缓冲液2.5ml、10% SDS溶液4.0ml、甘油2.0ml、巯基乙醇1.0ml、溴酚兰指示液0.5ml，混匀，分装Eppendof管冰冻保存。

(生物秀实验频道)注：非还原型电泳中样品缓冲液不加巯基乙醇，其它均相同。

10．电泳缓冲液（0.05M Tris，pH8.3，0.384M甘氨酸，0.1% SDS）用天平称取12.1g Tris，57.6g甘氨酸，加10% SDS溶液20ml，再加去离子水定容至2L。

（此溶液一般可使用4~5次，当电泳胶染色后出现较多杂带和本底时，应重新配制。

）11．染色液储存液（1% 考马斯亮兰R-250）称取2.0g考马斯亮兰R-250，加去离子水溶解并定容至200ml，滤纸过滤（以除去颗粒状物质）。

12．染色液（0.125% 考马斯亮兰，50% 乙醇，10% 乙酸）取染色液储存液62.5ml、乙醇250ml、乙酸50ml，加去离子水至500ml。

注：50% 乙醇也可用45% 甲醇代替，但甲醇毒性比乙醇大，不建议使用。

13．脱色液I（50% 乙醇，10% 乙酸）取乙醇500ml、乙酸100ml，加去离子水至1L。

14．脱色液II（5% 乙醇，7% 乙酸）取乙醇50ml、乙酸70ml，加去离子水至1L。

15．银染试剂1）固定液（50% 乙醇，0.02% 甲醛）：取乙醇250ml、37% 甲醛270μl，加水至500ml。

小心：甲醛蒸汽有毒，含有甲醛的溶液应在通风橱中配制。

2）1% 戊二醛液：取25% 戊二醛液20ml，加水至500ml。

3）硝酸银溶液（用前新鲜配制）：称取0.8g硝酸银，加水4.0ml溶解，将此溶液加到0.1M NaOH溶液20ml和25% 氨水1.5ml的混和液中，用水稀释至100ml。

16．银染显色液取1% 柠檬酸2.5ml、37% 甲醛270μl，加水至500ml。

17．终止液（10% 乙酸）取乙酸100ml，加水至1L。

三．操作方法1．夹心式垂直电泳槽使用方法1）清洗部件：用去污剂清洗长短玻璃板、胶模框及样品梳，用自来水彻底冲洗，再用去离子水不洗净，放置晾干或用滤纸擦干（注意不要留下纤维）待用。

如有必要，也可先用5% KOH甲醇溶液（5g KOH溶于100ml甲醇）清洗玻璃板，再按以上步骤洗净。

小心：KOH有腐蚀性，取用时应戴手套和面具。

2）组装电泳槽：①将四只固定螺杆插入带红色电极头贮槽框的孔中，然后将贮槽框仰放在桌上。

②左手拿胶模框，右手从边上握住短玻璃板向下插入到胶模框的短槽（三边有槽的即是）内，然后以同样方法将长玻璃板插入到长槽（左右两边有槽的即是）内，注意手指不要接触玻璃板的凝胶面（以免留下油脂，使灌胶时产生气泡），压紧边框。

③将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐。

④将另一半贮槽框与桌上的贮槽框相合，并使胶模框上的凸出线位于贮槽框边的中间。

⑤装上四只螺母并拧紧，注意拧螺母时应用力均匀，最好用双手按斜线位置双双逐渐拧紧。

⑥将电泳槽垂直放于桌上，带短玻璃板的贮槽称上槽（阴极端），带长玻璃板的贮槽称下槽（阳极端），在玻璃板与胶模框间有一缝隙，此缝隙可用已熔化的2% 琼脂沿玻璃板外边两侧灌入，以防止漏胶。

底部如留有气泡，可稍抬起一端，即可赶走气泡。

（注意待琼脂完全凝固后才能倒入胶液灌胶。

）2．凝胶制备1）15% 分离胶的制备试剂名称体积终浓度30% 丙烯酰胺液 5.0ml 15%分离胶缓冲液 2.5ml 0.375M Tris-HCl10% SDS溶液0.1ml 0.1%去离子水 2.4ml ——10% APS溶液60μl0.06%TEMED 6μl0.06%①将上述试剂在小烧杯中依次混合。

②一旦加入TEMED后，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物，使混匀后沿长玻璃板内侧缝隙加入（注意将长玻璃板内侧各处都沾湿，以防加隔离水层时水面不平），至与电极丝相平处，留出灌注积层胶所需空间（样品梳齿长加2cm）。

③用滴管在胶液上缓慢而小心地（切忌冲入下层胶液），加上一层约5mm厚的分离胶覆盖液（也可用水代替，可防止氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应），让其在室温下（最好在30~50℃）聚合（注意胶未凝聚前禁止摇动模具）。

④待胶凝聚后（水与凝胶层的界面消失后又再出现时，约15分钟），尽可能倒出覆盖液，用滤纸条吸干残留液体（注意不要留下纤维）。

2）4% 样品浓缩胶的制备试剂名称体积终浓度30% 丙烯酰胺液 1.35ml 4%浓缩胶缓冲液 2.5ml 0.125M Tris-HCl10% SDS溶液0.1ml 0.1%去离子水 6.0ml ——10% APS溶液60μl 0.06%TEMED 6μl 0.06%①将上述试剂在小烧杯中依次混匀。

②倒入模具中分离胶上，插入干净的样品梳（注意避免混入气泡），让其在室温下凝聚（约30分钟）。

3．样品处理1）对照液：取一瓶Genotropin (4IU)，加蒸馏水2ml，测A280应约为0.6（浓度约为0.6μg/μl）。

取10μl与2X样品缓冲液10μl混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为10μl （约3μg）。

2）原料或成品：用蒸馏水配成1μg/μl的溶液，取10μl与2X样品缓冲液10μl混匀，100℃水浴加热3 分钟。

上样量为10μl（约5μg）。

3）中间体液：①011、012样品：取样品液与2X样品缓冲液1:1混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为20~50μl，酌情加减，一般为30μl。

②013样品：取样品液与2X样品缓冲液1:1混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为165/A280（μl），如下表：A280 &3.5 3.5~5.0 5.0~6.0 6.0~7.5 7.5~9.5 9.5~13上样量50μl 40μl 30μl 25μl 20μl 15μl注：当不知A280时，可按前一批上样量或上30μl。

③014、015样品：取样品液加1倍体积的水、2倍体积的2X样品缓冲液，混匀，100℃水浴加热3分钟。

当A280&10时，上样量与同批013 样品相同，一般为30μl；当A280<10时，上样量为同批013样品的4/5。

④016S样品：将样品液稀释至A280≈1，取30μl与2X样品缓冲液30μl混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为30~40μl。

⑤016、017样品：将样品液稀释至A280为0.5~1.0，取30μl与2X样品缓冲液30μl 混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为20/A280（μl）。

⑥018sp样品：将样品液稀释至A280≈0.5，取30μl与2X样品缓冲液30μl混匀，100℃水浴加热3分钟。

上样量为10/A280（μl）。

4．上样1）上样前在已制好胶的电泳槽中倒入电泳缓冲液，液面高度应超过上槽短玻璃板的上缘5mm，下槽只要超过电极丝即可。

2）双手缓慢小心地取出样品梳，即可看到界线清晰的加样孔。

如加样孔之间的胶条不平整，可用一平头针注射器校正。

3）用微量进样器吸取一定量已处理好的样品液或对照液，按预定顺序加入凹型凝胶加样孔中底部（注意校正胶条和加样时动作要轻缓，针头不要刺伤胶面）。

每加完一个样品应用水洗涤进样器。

不用的加样孔可加上等体积的1X样品缓冲液。

4）记下加样顺序。

5．电泳1）用导线将上槽电极与电泳仪负极相连，下槽电极与正极相连。

2）当样品在浓缩胶中时，调节电压使电流为10~12mA（电压为80~100V）。

3）当溴酚兰前沿进入分离胶后，调节电压使电流20~22mA（电压为100~200V）。

4）继续电泳至溴酚兰前沿接近分离胶底部3~5mm时（注意不要使染料逸出到下槽电泳缓冲液中），调节电压至零，关闭电源（整个过程需3~4小时）。

5）拆除导线，回收电泳缓冲液。

6．考马斯亮兰染色1）染色：电泳完毕后，松开螺栓，取出胶模框，剥出玻璃板。

用小不锈钢勺从浓缩胶一端轻轻撬开玻璃板（注意防止凝胶破裂），在凝胶右下角切去一小块以标注方位。

用水将凝胶冲洗至一培养皿中，尽可能倒去水，加入考马斯亮兰染色液至浸没胶面，并除去凝胶下的气泡（否则脱色后有花纹），固定染色过液。

2）脱色：次日弃去染色液，水洗2~3次后，加脱色液I浸没胶面，置摇床上脱色，2~3次（3~4小时）后，再用脱色液II脱色2~3次（3~4小时），直到凝胶上背景脱净为止。

水洗2~3次，记录结果。

注1：为加快脱色速度，可采用以下方法：a．用含30% 甲醇、10% 乙酸的混合液脱色。