抗人血小板单克隆抗体的制备及其临床应用_牟忠梅

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抗人淋巴细胞单克隆抗体的制备及抗CD4分子单抗的鉴定的开题报告

抗人淋巴细胞单克隆抗体的制备及抗CD4分子单抗的鉴定
的开题报告
一、研究背景
淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，其中CD4+ T细胞是主要的免疫调节细胞，对机体的免疫反应起着至关重要的作用。

在临床上，抗CD4单克隆抗体已被广泛应用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤及移植排斥等疾病。

然而，由于体内免疫反应的多样性及相互作用的复杂性，目前市场上的抗CD4单克隆抗体多具有较大的副作用和安全隐患，因此需要开展抗CD4单克隆抗体的研究与开发。

二、研究内容
本研究旨在制备抗人淋巴细胞单克隆抗体，并鉴定其对CD4分子的专一性。

具体研究内容包括以下几个方面：
1. 抗人淋巴细胞单克隆抗体的制备：采用小鼠-淋巴细胞杂交瘤技术，通过对小鼠免疫和融合细胞进行筛选，得到抗人淋巴细胞的单克隆抗体。

2. 抗CD4分子单抗的筛选：利用ELISA技术对上述制备的抗人淋巴细胞单克隆抗体进行筛选，以筛选出具有专一性的抗CD4分子单抗。

3. 抗CD4分子单抗的鉴定：对筛选出的抗CD4分子单抗进行亲和力、特异性和功能性指标等方面的鉴定，以评估其应用前景和安全性。

三、研究意义
本研究将有望提供一种安全、高效的抗CD4单克隆抗体，为临床医学提供更为理想的治疗手段，在治疗自身免疫性疾病、肿瘤及移植排斥等方面具有重要的应用价值。

同时，此研究还将有助于深入理解CD4分子与其它分子之间的相互作用及免疫调节机制的探索，对于深化免疫学研究、促进免疫治疗的发展具有重要的科学意义。

抗人红细胞M型抗原单克隆抗体的研制及初步应用

抗人红细胞M型抗原单克隆抗体的研制及初步应用杨桂云;刘淑玲;曾国华;朱建春;张志;李勇;刘玉华;李军【期刊名称】《单克隆抗体通讯》【年(卷),期】1992(8)2【摘要】应用杂交瘤枝术,用人M型RBC免疫的BALB/c小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞系NS-1融合,筛选出抗M血型抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株13H_2;经过8个多月连续传代培养增殖良好,仍能稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体。

细胞培养上清效价1∶512,亲和力11s。

通过将此株单抗用于血型检测、标准红细胞谱细胞的鉴定和在法医上检测血痕,均证明此株单抗识别的只是红细胞上的M血型抗原,与其它血型抗原无关。

较多克隆抗M型抗原血清特异性强,效价高,亲和力好,是检测MN血型的良好诊断试剂。

【总页数】4页(P53-56)【关键词】M抗原;杂交瘤细胞;单克隆抗体【作者】杨桂云;刘淑玲;曾国华;朱建春;张志;李勇;刘玉华;李军【作者单位】卫生部长春生物制品研究所;中国医科大学法医系;中国刑警学院物证室【正文语种】中文【中图分类】R392－33【相关文献】1.抗猪红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及鉴定 [J], 王云龙;王国强;闵玉涛;李恒思;陈小科;李玉林2.抗人A型红细胞单克隆抗体的研究及其初步应用 [J], 邹亚伟;郭景元;陈跃龙3.三株抗人B淋巴细胞表面抗原单克隆抗体的研制及初步鉴定 [J], 宋强;张明珙4.抗人A型红细胞单克隆抗体的研制及初步应用 [J], 邹亚伟;郭景元;陈跃龙5.抗前列腺特异性膜抗原膜外区多肽单克隆抗体的研制及初步应用 [J], 曹开源;杨羚;徐霖;袁广卿;张甜;丘少鹏;沈关心因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定》

《抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的制备与鉴定》一、引言抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体作为一种具有特定靶向性和高度敏感性的生物技术产品，在现代生物医学研究和临床诊断中扮演着至关重要的角色。

本篇论文旨在阐述该单克隆抗体的制备与鉴定过程，详细解析实验步骤，并对结果进行科学的分析和解读。

二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括：人红细胞、乙酰胆碱酯酶、抗体相关试剂等。

所有试剂均为进口高纯度产品。

2. 方法（1）单克隆抗体的制备a. 抗原的制备与纯化：从人红细胞中提取乙酰胆碱酯酶，进行纯化处理。

b. 融合与筛选：将纯化的抗原与骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。

c. 抗体的大量制备与纯化：通过体外培养杂交瘤细胞，收集上清液，进行抗体的大量制备与纯化。

（2）单克隆抗体的鉴定a. 抗体特异性鉴定：采用免疫学方法，如ELISA、Western Blot等，检测抗体的特异性。

b. 抗体亲和力鉴定：通过竞争性抑制实验，测定抗体与抗原的结合力。

c. 抗体亚型鉴定：采用分型试剂盒，测定抗体亚型。

三、实验结果1. 单克隆抗体的制备结果通过融合与筛选，成功获得能产生特异性抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的杂交瘤细胞。

在体外培养下，杂交瘤细胞生长良好，上清液中抗体含量丰富。

2. 单克隆抗体的鉴定结果（1）抗体特异性鉴定：通过ELISA和Western Blot实验，证实该单克隆抗体具有较高的特异性，能与人红细胞乙酰胆碱酯酶特异性结合。

（2）抗体亲和力鉴定：竞争性抑制实验结果显示，该单克隆抗体与抗原的结合力较强，具有较高的亲和力。

（3）抗体亚型鉴定：通过分型试剂盒测定，该单克隆抗体属于IgG型。

四、讨论本实验成功制备了抗人红细胞乙酰胆碱酯酶单克隆抗体，并对其进行了全面的鉴定。

该抗体具有较高的特异性和亲和力，可与人红细胞乙酰胆碱酯酶特异性结合，为后续的生物医学研究和临床诊断提供了有力的工具。

然而，该抗体的制备过程仍需进一步优化，以提高产量和纯度。

单克隆抗体制备技术及临床应用的研究进展_张华

单克隆抗体制备技术及临床应用的研究进展张华1 胡成进2(1.泰山医学院免疫学教研室,山东泰安 271016; 2.济南军区总医院实验诊断科,山东济南 250031)关键词:抗体;单克隆抗体;制备中图分类号:R392 文献标识码:A 文章编号:1004 7115(2010)11 0890 031975年Koh ler和M ilste i n建立了杂交瘤技术,将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞抗体的小鼠脾细胞融合,形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖,且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇,称为单克隆抗体,单克隆抗体经历了鼠源性、人源性和全人化抗体三个阶段。

迄今为止世界上已研制出数以千计的单克隆抗体,并广泛应用于生物学、医学领域,在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要作用。

本文从单克隆抗体的制备技术和临床应用方面进行综述。

1 单克隆抗体制备技术1.1 杂交瘤技术该技术主要包括免疫动物、细胞融合和杂交瘤细胞的筛选三个环节。

1.1.1 免疫动物目前常用B ALB/C小鼠,也可用SC I D小鼠(severe conbined i m m um deficie my m ice)、转基因小鼠、转染色体小鼠,用特定的外来抗原一次或多次免疫动物,刺激B淋巴细胞增殖形成浆细胞,分泌针对该抗原的抗体。

1.1.2 细胞融合常用骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合,通常采用PEG法或PEG电融合法,该法稳定,安全简单;也有报道用小鼠的腘窝淋巴结细胞和骨髓瘤细胞融合,5周内成功产生抗病毒的小鼠单抗。

1.1.3 杂交瘤细胞筛选 HAT选择培养基有3种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、甲氨蝶呤(a m i n opteri n,A)和胸腺嘧啶核苷(thy m i d i n e,T),A 是二氢叶酸还原酶抑制剂,可阻断核酸合成的主要途径。

B淋巴细胞可通过补救途径,由胸腺嘧啶激酶(thy m idi n e kinase,TK)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guan i n e phosphori b osy trans ferase,HGPRT)利用T和H合成核酸,但不能在体外长期生存;骨髓瘤细胞缺乏H GPRT,不能在该培养基中生长;杂交瘤细胞具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性,在HAT培养基中长期生存又可产生抗体,成为制造单克隆抗体的细胞源。

一种抗人白血病细胞KG-1凝集性单克隆抗体的制备方法[发明专利]

专利名称：一种抗人白血病细胞KG-1凝集性单克隆抗体的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：颜江华,王生育,罗芳洪,吴婷
申请号：CN201810292992.8
申请日：20180403
公开号：CN108640995A
公开日：
20181012
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种抗人白血病细胞KG‑1凝集性单克隆抗体的制备方法，涉及单克隆抗体。

制备免疫原；动物免疫；小鼠血清凝集效价测定；细胞融合、筛选及克隆化；抗体的制备与纯化。

采用活细胞直接对小鼠多次进行腹腔注射的免疫方式，制备抗人白血病细胞KG‑1凝集性单克隆抗体，并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为人白血病凝集性抗体的应用研究奠定基础。

通过高效的单克隆抗体制备技术，以体外培养的人白血病细胞KG‑1作为免疫原，腹腔注射免疫小鼠，通过凝集筛选获得能促使人白血病细胞KG‑1产生特异性凝集反应的单克隆抗体。

其单克隆抗体的获得将对白血病的研究和临床治疗有重要意义。

申请人：厦门大学
地址：361005 福建省厦门市思明南路422号
国籍：CN
代理机构：厦门南强之路专利事务所(普通合伙)
代理人：马应森
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抗人SCGN的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株[发明专利]

专利名称：抗人SCGN的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株
专利类型：发明专利
发明人：来茂德,李风英,徐恩萍,马裕
申请号：CN200810060114.X
申请日：20080307
公开号：CN101270162A
公开日：
20080924
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种抗人促泌素(secretagogin，SCGN)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第204～1034位核苷酸编码的多肽具有特异性，由保藏编号为CCTCC No：C200729的细胞株分泌产生。

在本发明基础上可建立灵敏、可靠的外周血检测方法，检测神经内分泌肿瘤、尤其是小细胞肺癌的外周血，为评估其对于诊断、预后及临床治疗效果检测提供了理论基础，具有重大应用前景。

申请人：浙江大学
地址：310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号
国籍：CN
代理机构：杭州天正专利事务所有限公司
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一株特异抗人血浆Lp（a）单克隆抗体（A5g3）的制备及特征分析

一株特异抗人血浆Lp（a）单克隆抗体（A5g3）的制备及特
征分析
陈红杰;沃兴德
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】1996(012)005
【摘要】用序列超速离心和柱层析分离纯经的人血浆脂蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，得到具有对Ｌｐ（ａ）高抗体活性的小鼠脾细胞，与小鼠ＮＳ１骨髓瘤细胞经聚二乙二醇杂交蛤，建立分泌特异抗人血浆Ｌｐ（ａ）的单克隆杂交瘤细胞地其中一株单克隆细胞株－Ａ５ｇ３进行了初步分析。

【总页数】4页(P307-310)
【作者】陈红杰;沃兴德
【作者单位】山西医科大学生化教研室;浙江中医学院分子医学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
【相关文献】
1.一株A和B亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备及其特性 [J], 邱玉玉;李晓霞;武专昌;崔治中;孙淑红;张显忠
2.一株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 [J], 曹莎莎;徐永芳;郑小翠;葛彦;居颂文;居颂光
3.抗阪崎肠杆菌LPS单克隆抗体的制备及初步应用 [J], 马卫静;李克生;杜惠芬;彭
洪江;杜丽娟;连晓雯
4.一株鼠抗人CD36单克隆抗体的制备及应用 [J], 陈大伟;叶欣;徐秀章;夏文杰;邵媛;王嘉励;刘静;邓晶;陈扬凯;丁浩强
5.抗P^(21)蛋白/抗CD_3双特异性单克隆抗体制备及细胞毒活性研究 [J], 孙立群;徐彦萍;郭丽娟;陈力
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抗人TPO单克隆抗体的制备

抗人TPO单克隆抗体的制备
岱美茹;陆爱丽
【期刊名称】《北京医科大学学报》
【年(卷),期】1997(029)003
【摘要】制备抗人血小板生成素单克隆抗体，用于建立ＥＬＩＳＡ方法和检测Ｔ
ＰＯ的表达。

用基因重组的ｈＴＰＯ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，常规法做细胞融合，用ＥＬＩＳＡ法筛选出阳性杂交瘤细胞株。

结果；获得一杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白亚类为ＩｇＧ１和ＥＬＩＳＡ和免疫印迹技术证明，此单抗能特异识别ＴＰＯ。

【总页数】3页(P265-266,272)
【作者】岱美茹;陆爱丽
【作者单位】北京医科大学分析计算中心;北京医科大学分析计算中心
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
【相关文献】
1.检测人血型抗A和抗B单克隆抗体的制备 [J], 张先敏
2.不育或流产患者抗精子及抗附睾的人单克隆抗体制备 [J], 龚亚奇;郎信夫
3.与顶体反应相关的抗人精子单克隆抗体及其抗原的特性Ⅰ顶体反应的诱导及抗
顶体反应精子的单克隆抗体的制备 [J], 王云美;贲昆龙;曹筱梅
4.抗TPO单克隆抗体的制备及初步鉴定 [J], 徐荣佳;刘军权;方蕾;姚仁南;陈晓英;
徐广奎;陈复兴
5.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1．抗人λ轻链亚型／亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱
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抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51的研制及其在血栓研究中的作用

抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51的研制及其在血栓研究中的作用阮长耿;吴国新;顾建明;李佩霞;万海英;吴锦昌;何广仁【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2001(030)004【摘要】@@ 血小板的活化是血栓形成过程中一个重要的病理过程.本研究室利用杂交瘤技术制备了国内第一株抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51,并利用这株单抗对血小板的活化及其在血栓形成和血栓性疾病的发病机理、诊断和治疗中的应用价值等方面进行了研究.现将我室七年来在SZ-51方面研究的科研成果归纳如下:【总页数】2页(P25-26)【作者】阮长耿;吴国新;顾建明;李佩霞;万海英;吴锦昌;何广仁【作者单位】苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006;苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所,215006【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.抗人活化血小板嵌合单克隆抗体SZ-51/Hu的纯化、鉴定和核素标记 [J], 张玮;阮长耿2.抗人活化血小板单克隆抗体在脑血栓诊断中的应用研究 [J], 包仕尧;李文3.抗人活化血小板表面α-颗粒膜蛋白GMP-140单克隆抗体SZ-51的研制应用(摘要) [J], 阮长耿;吴国新;李佩霞4.^（99m）Tc抗人活化血小板单克隆抗体SZ－51对狗动、静脉血栓的放免显像研究 [J], 吴锦昌;何广仁;阮长耿5.^(99)Tc^m-抗人活化血小板单抗SZ-51对犬冠状动脉血栓的放免显像研究 [J], 吴锦昌;沈利明;陆之安;阮长耿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

利用抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ—21测定生物材料表面粘附血小板数的新方法

利用抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ—21测定生物材
料表面粘附血小板数的新方法
奚廷斐;田文华;王春仁;雷学惠;阮长耿;万海英
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】1995(000)010
【摘要】本课题对三种血小板膜糖蛋白单克隆抗体进行了筛选.研究了由单克隆抗体SZ—21,用固相放射免疫技术测定生物材料表面粘附血小板的新方法.对聚氨酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺-胺等47种医用高分子材料进行了定量测定。

【总页数】1页(P20-20)
【作者】奚廷斐;田文华;王春仁;雷学惠;阮长耿;万海英
【作者单位】中国药品生物制品检定所;中国药品生物制品检定所;苏州医学院
【正文语种】中文
【中图分类】R318.08
【相关文献】
1.抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2单链抗体的构建、表达及功能研究 [J], 戴
克胜;祝怀平;阮长耿
2.利用抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ—21测定生物材... [J], 奚廷裴;万
海英
3.抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体rn抑制兔血栓形成的实验研究 [J], 刘晓健;
安广宇;董宁征;邵波静;阮长耿
4.^(99)Tc^m标记人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ21F(ab)_2血栓栓塞显像 [J], 季顺东;方纬;范磊;董宁征;刘秀杰;阮长耿;何作祥
5.抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21基因克隆及单链抗体的构建和表达 [J], 安广宇;董宁征;阮长耿
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2. 结果 2. 1 杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
经检测，细胞融合率为 95％；阳性孔有 5 孔，阳性率为 1. 4％；在阳性杂交瘤细胞株中选择分泌抗体效价高的 1C1 株进行克隆和扩大化培养，经连续 6 次克隆，单克隆 100％阳性。 2. 2 杂交瘤细胞株的鉴定 2. 2. 1 稳定性：1C1 细胞株连续传代 8 个月以上，增殖良好，传代稳定，能连续分泌高效价抗体，上清效价可达 1 ∶ 106。于液氮中冻存第 2 周、1、2、3、6、12 个月，复苏后的细胞增殖稳定，细胞培养上清抗体效价为 1 ∶ 106，与冻存前一致，说明细胞分泌抗体性能稳定。 2. 2. 2 染色体分析：检测结果显示，1C1 株杂交瘤细胞的染色体数为 86 ～ 94 条，为杂交瘤染色体核型。 2. 3 单克隆抗体的鉴定 2. 3. 1 效价：间接 ELISA 结果显示，4 批 1C1 株杂交瘤细胞培养上清的单克隆抗体效价均为 1 ∶ 106，见表 1。 2. 3. 2 稳定性：检测结果显示，1C1 株杂交瘤细胞培养上清于 37℃放置 35 d，抗体效价维持在 1 ∶ 106，之后下降，见图 1。表明细胞培养上清中的抗体效价在 37℃可稳定 35 d。 2. 3. 3 抗原决定簇：所获得的 1C1 株单克隆抗体特异性针对人血小板糖蛋白 Ib ／ IX。 2. 3. 4 纯化单抗的效价：纯化后的抗体效价可达 1∶108。 2. 4 单克隆抗体的应用
用 0. 05 mol ／ L 的碳酸盐缓冲液（pH 9. 6）将纯
化的单抗稀释至 15 μg ／ ml，包被 U 型微孔板，100 μl ／孔，置 4℃过夜；次日，用 1％牛血清白蛋白（150 μl ／孔）于 4℃封闭过夜；用该反应板检测临床患者血清样本中是否含有血小板抗体：向反应孔中加入 50 μl 混合血小板悬液，50 × g 离心 5 min，清洗 3 次，立即加入 100 μl 低离子强度溶液，并分别向相应孔中加入 50 μl 患者血清样本，并设阳性对照及阴性对照，37℃ 水浴孵育 30 min；洗涤 5 次，加入 50 μl 抗人 IgG（自制）及 50 μl 人 IgG 致敏红细胞（自制），200 × g 离心 5 min 后观察结果。用上述建立的固相凝集法对 50 例临床患者血清样本进行检测，并以同类试剂盒（MASPAT）进行平行检测，分析二者检测结果的一致性。
采用间接 ELISA 法。将兔抗人血小板多抗（自制）用 0. 05 mol ／ L 碳酸盐缓冲液（pH 9. 6）稀释至 15 μg ／ ml，包被酶标板，100 μl ／孔，置 4℃过夜；次日，用 1％牛血清白蛋白（150 μl ／孔）4℃封闭过夜；将杂交瘤细胞培养上清加入包被板，100 μl ／孔，同时设阴、阳性对照，置 37℃孵育 2 h；用含 Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 5 次，加入 AP 标记的羊抗鼠 IgG，置 37℃孵育 45 min；洗涤 5 次，加入底物 50 μl，室温避光显色 30 min。选择阳性孔克隆培养，连续多次克隆至单克隆 100％阳性，经传代培养后，将杂交瘤细胞冻存。 1. 7 杂交瘤细胞株的鉴定 1. 7. 1 稳定性检测：将阳性杂交瘤细胞株连续传代 8 个月以上，观察其增殖情况，并检测细胞培养上清效价。将液氮中冻存的细胞株分别于冻存第 2 周、1、 2、3、6、12 个月后复苏，观察其增殖情况，并于复苏 3 d 后测定细胞培养上清效价。 1. 7. 2 染色体分析：参考文献［5］方法进行。 1. 8 单克隆抗体的鉴定 1. 8. 1 效价测定：将收获的 4 批阳性杂交瘤细胞培养上清分别稀释 1 000、5 000、10 000、50 000、100 000 和 1000 000 倍，检测抗体效价。 1. 8. 2 稳定性检测：取阳性杂交瘤细胞培养上清 20 ml，分别于 37℃放置 7、14、21、28、35、42、49、56、 63 和 70 d，检测抗体效价。 1. 8. 3 抗原决定簇的鉴定：将血小板相关糖蛋白包被于酶标板中，采用间接 ELISA 法，经德国古森大学临床免疫与输血医学研究所检测单抗所针对的血小板糖蛋白。 1. 8. 4 腹水的制备、纯化及检测：将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，采集腹水，利用活化 4B 进行亲和层析纯化。 1. 9 单克隆抗体的应用
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中国生物制品学杂志 2011 年 6 月第 24 卷第 6 期 Chin J Biologicals June 2011，Vol. 24 No. 6
试剂盒购自德国欧蒙公司。 1. 5 动物免疫及细胞融合
取人 O 型血小板，浓度为 108 个／ ml，与弗氏完全佐剂混合，乳化，经足底及背部多点免疫 BALB ／ c 小鼠，0. 2 ml ／只；间隔 10 d 后进行第 2 次免疫，用不完全弗氏佐剂配制，浓度为 108 个／ ml，经小鼠腹腔免疫，0. 2 ml ／只。以后每隔 1 周免疫 1 次，共免疫 3 ～ 4 次，于融合前 3 d 经尾静脉加强免疫，0. 2 ml ／只。取免疫小鼠脾细胞，与 NS-1 细胞参照文献［3］方法进行细胞融合。 1. 6 杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
【Key words】 Platelet；Antibody，monoclonal
血小板表面具有复杂的血型抗原，其能通过多种
途径刺激机体产生血小板抗体，并引起血小板输注无效症、新生儿血小板减少症等多种免疫性疾病［1-2］。目前，血小板抗体检测方法的局限性仍是困扰临床
诊断的一大难题，如固相凝集法通常采用甲醛将血
小板固定于 U 型微孔板底部，检测血小板抗体，然而多项研究表明，甲醛固定可引起抗原构型改变，
以致血小板抗原出现丢失，最终导致血小板抗体漏检［3-4］。而通过抗人血小板单克隆抗体将血小板固定则可解决这一问题，避免漏检。为此，本文制备了抗人血小板单克隆抗体，并用于临床血小板抗体检
基金项目：吉林省医学免疫诊断制品科技创新中心项目（20071124）．
中国生物制品学杂志 2011 年 6 月第 24 卷第 6 期 Chin J Biologicals June 2011，Vol. 24 No. 6
抗人血小板单克隆抗体的制备及其临床应用
牟忠梅 1 段生宝 2 刘颖 1 李春明 3 陈喜朋 1 李勇 1
·699· 【诊断制品】
【摘要】目的制备抗人血小板单克隆抗体，并应用于临床血小板抗体的筛检及血小板交叉配型。方法以人 O 型血小板为免疫原，免疫 BALB ／ c 小鼠，将 NS-1 细胞与免疫小鼠脾细胞融合，间接 ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法克隆，并对阳性杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体进行鉴定；采用亲和层析法纯化单抗，用该单抗建立固相凝集法，检测临床患者血清样本，并与德国欧蒙公司的同类试剂盒（MASPAT）检测结果进行比较。结果获得 1 株抗人血小板杂交瘤细胞株 1C1，其分泌的单抗性能稳定，可特异性针对人血小板糖蛋白 Ib ／ IX，细胞稳定传代 8 个月以上，培养上清效价大于为 1 ∶ 106，37℃的稳定性可持续 35 d，纯化后的抗体效价可达 1 ∶ 108。建立的固相凝集法对 50 例临床血清样本的检测结果与同类试剂盒（MASPAT）一致。结论已制备了抗人血小板单克隆抗体，为其进一步临床应用奠定了基础。
【关键词】血小板；抗体，单克隆【中国图书分类号】 R392-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2011）06-0699-03
Preparation and Clinical Application of Anti-Human Platelet Monoclonal Anti－ body
临床患者血清样本由吉林大学中日联谊医院血液科提供。 1. 3 细胞
NS-1 细胞由长春生物制品研究所提供。 1. 4 主要试剂
人 O 型血小板由长春市中心血站提供；AP 标记的羊抗鼠 IgG、PEG、氨基喋呤、次黄嘌呤及胸苷购自 Sigma 公司；RPMI1640 购自 GIBCO 公司；MASPAT
作者单位：1 长春博德生物技术有限责任公司（长春 130012）；2 长春生物制品研究所（长春 130062）；3 长春百克生物技术股份有限公司（长春 130012）．
通讯作者：牟忠梅，E-mail：mouzhongmei74＠126．com

测，现报道如下。
1. 材料与方法 1. 1 实验动物
清洁级 BALB ／ c 小鼠，6 周龄，雌性，体重 18 ～ 20 g，由吉林大学新民校区动物实验室提供。 1. 2 血清样本
MU Zhong-mei△，DUAN Sheng-bao，LIU Ying，LI Chun-ming，CHEN Xi-peng，LI Yong （△Changchun Brother Biotech Co． Ltd，Changchun 130012，China）
【Abstract】 Objective To prepare anti-human platelet monoclonal antibody（McAb）used for clinical screening of platelet an－ tibody and cross matching of platelet． Methods BALB ／ c mice were immunized with platelet group O as immunogen，of which the splenocytes were fused with NS-1 cells． Positive hybridoma cells were screened by indirect ELISA and cloned by limiting dilution method． The positive hybridoma cells and the secreted McAb identified，and the McAb was purified by affinity chromatography and used for development of solid agglutination method． Clinical blood samples were determined by the developed method，and the result was compared with that by MASPAT kit． Results A hybridoma cell strain 1C1 stably secreting anti-human platelet McAb was ob－ tained，by which the secreted McAb was specific to human platelet glycoprotein Ib ／ IX． After the cells were subcultured for more than 8 months，the titer of McAb in culture supernatant was 104，which lasted for 35 d at 37℃． The titer of purified antibody reached 1 ∶ 108． The determination results of 50 blood samples by the developed solid agglutination method were consistent with that by MAS－ PAT kit． Conclusion Anti-human platelet McAb was successfully prepared，which laid a foundation of its further clinical application．