人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1. 前言 (1)2. 人类胚胎成纤维细胞培养 (2)3. 重编程载体构建 (3)4.病毒包装 (4)5.人类iPS细胞的诱导 (6)6. iPS细胞鉴定 (8)6.1碱性磷酸酶活性检测 (8)6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9)6.3干性因子的去甲基化程度分析 (10)6.4干细胞内源基因的表达分析 (13)6.5端粒酶活性检测 (14)6.6核型检测 (15)6.7拟胚体形成 (15)6.8畸胎瘤形成实验 (15)7．干细胞技术培训及服务一览表 (15)8．附录 (16)1. 前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。
其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。
2006年Y amanaka 和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和Klf4，Y amanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。
2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。
由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。
随后，iPS细胞的研究日新月异。
. 近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。
一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。
斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。
目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方便科研工作者做后续的研究。
另外，对于新手提供初学者试剂盒：这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。
2. 人类胚胎成纤维细胞培养材料：✓人胚肺成纤维细胞：货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支；✓人类胎儿包皮成纤维细胞：货号SDSC-17，规格1*106/支；✓0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；✓含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。
实验步骤：人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。
先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS 的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。
传代比例为1：3－1：5。
Point此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。
细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止生长。
传代间隔时间为3－4天。
3. 重编程载体构建用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：4.病毒包装材料：✓293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01✓转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001实验步骤1．包装细胞铺板：①. 传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37°C培养箱放置10min以上。
②. 传代293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL 37°C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。
之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul DMEM培养液，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。
计数板上共4大格，每大格16小格。
计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。
③. 铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。
细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。
）2. 转染：第二天做转染前先观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。
转染前无需换培养基。
做脂转complex：Opti MEM需在37°C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。
转染每瓶T75的complex成分如下：含cDNA的lv质粒：10ugpVSVG：5ugdelta 8.91：7.5ugopti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene 转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。
再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。
晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。
3．收集病毒：转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM 培养液10mL，即开始收集病毒。
分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4°C冰箱短期保存。
4．病毒滴度测定：收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）：①. 在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul明胶）。
②. 消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。
可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/ 15万细胞即可。
③. 将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。
分别取2ul或者5ul病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。
48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。
5．病毒滴度确定：①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。
②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。
用PBS涮3次。
加入4％PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。
③．用PBT洗2次，每次3分钟。
④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。
⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。
⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×1.5×105×1036．停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。
7．病毒在感染目的细胞前用0.45um滤膜过滤后，预热方可使用。
我们提供的主要包装病毒：此外，我们还提供相关的病毒包装培训，为期1周。
学成后方便迅速搭建平台。
5.人类iPS细胞的诱导材料：✓已经测定好滴度的慢病毒(以6种为例)✓体细胞（以人类胎儿包皮成纤维细胞为例）货号：Sidansai，SDSC-17 ✓助转剂polybrene：Sidansai，货号M-020✓胰酶：Sidansai，货号M-005-2✓0.1% gelatin：明胶，Sidansai，货号M-004✓DMEM(含10%FBS)培养液：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01✓滋养层细胞（CF-1 MEF cells）：Sidansai，货号MEF-CF1-01✓人类胚胎干细胞培养液：Sidansai，货号HESM-01-500✓人类胚胎干细胞条件培养基：Sidansai，货号HESCM-01-100✓基质胶：Sidansai，货号M-002Point：6种病毒所含基因分别为：OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4;由预实验可知，慢病毒感染MRC-5 细胞的比例为10：1（即10个病毒颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。
病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染效率，细胞生长不受影响，故均可用。
开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（MEF）。
病毒感染步骤：（悬浮感染方案）a. 先用0.1% gelatin预包被一个T25 瓶，包被时间约为10min。
b. 待细胞生长良好时，用0.25%trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数（具体过程见成纤维细胞培养protocol）。
之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1×105）。
c. 若感染1×105的细胞，以感染比例10：1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。
d. 然后将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25 瓶中, 摇匀后放入37°C培养箱中，过夜。
e. 病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。
按T75瓶每瓶铺5×104的细胞，铺2个T75瓶即可。
f. 第2天，将DMEM培养液换成hESC培养液，继续培养。
以后每2天换液一次。
g. 逐日观察，待细胞长至第5－7天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。
h. 直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM(conditioned medium)+HES(hESC正常培养液)的1:1混合液, 以提供给细胞充足的营养。
i. 待细胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES-like clone挑至新的MEF上，按hESC培养方法继续培养，扩增。
