十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法(CE-SDS法)标准操作规程SOP

颁发部门：质量保证部分发部门：分析研究部拷贝号：NO. /目录1目的 (4)2范围 (4)3定义 (4)4环境、健康和安全 (4)5培训 (4)6职责 (4)7程序（内容） (4)7.1原理 (4)7.2实验材料 (4)7.3操作步骤 (5)7.4结果分析 (9)7.5判定标准 (9)7.6注意事项 (9)8相关文件 (10)9参考文献 (10)10流程图 (10)11附录 (10)十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法（CE-SDS法）测定记录 (1)十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法（CE-SDS法）测定记录(适用于多个样品) (1)1目的规范十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法（CE-SDS法）检验的操作过程。

2范围本规程适用于常规十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳检验，涉及到蛋白质纯度相关指标的测定。

3定义3.1CE-SDS：十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳。

4环境、健康和安全还原电泳中使用的巯基乙醇为挥发性液体，具有较强烈的刺激性气味，会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，吞食有害，与皮肤接触有毒，取液时穿戴适当的防护服、手套和护目镜或面具。

如不慎与眼睛接触后，请立即用大量清水冲洗并征求医生意见。

该液体对水体环境能产生长期污染等不良影响，切勿倒入下水道，应倒入废液桶，由专业部门回收。

与空气混合、受热、明火可爆，如其燃烧可用二氧化碳、干粉类灭火剂。

储存库房应通风低温干燥，与氧化剂、食品分开储运。

5培训5.1培训部门：分析研究部。

5.2培训对象：分析研究部相关人员。

5.3培训方式和时数：自学，0.5小时。

5.4考核方式：问答。

6职责6.1质量保证部：负责监督本文件的执行。

6.2分析研究部：负责严格执行本规程规定。

7程序（内容）7.1原理该方法是指以弹性石英毛细管为分离管道，以高压直流电场为驱动力，通过目标蛋白在含有胶的溶液中的迁移速率不同而得到分离，较小分子量的分子迁移速度更快则其迁移时间短，较大分子的迁移速度慢则其迁移时间更长。

该方法主要能检测分子量在10kDa以上的降解片段。

7.2实验材料7.2.1试药与试液7.2.1.1超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本方法所有试液均用超纯水配制。

7.2.1.2SDS-MW Analysis Kit：Beckman生产，货号390953，该试剂盒中包含SDS-MW凝胶分离缓冲液、SDS-MW样品缓冲液（样品稀释液）、酸性清洗液（0.1mol/L 盐酸溶液）、碱性清洗液（0.1mol/L氢氧化钠溶液）、内标物质（10kDa Internal Standard）。

也可采用北京博思雅生化技术研究院生产的SDS试剂盒，货号BSYK018，该试剂盒中包含CE-SDS Gel Buffer、CE-SDS Sample Buffer（样品稀释液)。

也可采用同类型其它品牌的商品化试剂盒。

7.2.1.3烷基化溶液（0.25mol/L碘乙酰胺溶液）：称取约0.046g碘乙酰胺，加入1ml 超纯水溶解混匀，可于2~8℃避光保存7天。

7.2.1.42-巯基乙醇。

7.2.1.5系统适用性样品：如无特殊规定，应采用经特殊处理后的系统适用性专用样品（处理方法见各项目下规定）；也可选用相应原研药或各项目自制工作对照品。

7.2.2仪器与用具7.2.2.1毛细管电泳仪：AB SCIEX公司PA 800plus或CESI 8000 Plus。

7.2.2.2毛细管卡盒：适用于7.2.2.1中毛细管电泳仪的毛细管卡盒。

7.2.2.3毛细管：非涂层-熔融石英毛细管（内径50μm），切割至总长为30.2cm，高分辨率方法有效分离长度为20cm，高效方法有效长度为10cm。

7.2.2.4孔塞：孔塞大小8（100μm×800μm）。

7.2.2.5其他：CE通用样品瓶、蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖、200μl微量管（内插管）、移液器、水浴锅（或金属浴）、台式离心机、离心管、超滤管。

7.3操作步骤7.3.1供试品制备7.3.1.1供试品稀释（1）空白对照：取当次检测供试品对应的缓冲液（如原液缓冲液或制剂缓冲液），分别用稀释液（SDS样品缓冲液）进行稀释（稀释倍数同供试品），作为空白对照。

（2）系统适用性：取各项目下规定的系统适用性样品，用稀释液（SDS-MW样品缓冲液）稀释至终浓度约为1.0mg/ml。

（3）原液：根据待测原液浓度，用稀释液（SDS-MW样品缓冲液）稀释至终浓度约为1.0mg/ml。

（4）成品：若为液体制剂，根据标示含量，直接用稀释液（SDS-MW样品缓冲液）稀释至终浓度约为1.0mg/ml；若为冻干制剂，则先用水复溶后，根据复溶后理论含量，再用稀释液（SDS-MW样品缓冲液）稀释至终浓度约为1.0mg/ml。

7.3.1.2非还原供试品溶液制备：取稀释后供试品溶液各95μl，各加入10kDa Internal Standard 2μl，再各加入0.25mol/L碘乙酰胺溶液5μl，涡旋混匀。

7.3.1.3还原供试品溶液制备：取稀释后供试品溶液各95μl，各加入10kDa Internal Standard 2μl，再各加入2-巯基乙醇5μl，涡旋混匀。

7.3.1.4将各供试品溶液在70℃孵育，非还原供试品溶液孵育5分钟，还原供试品溶液孵育5~10分钟。

冷却至室温后以每分钟6000转离心1分钟。

从样品管中分别取出样品至200μl微量管中，将200μl微量管放入CE通用样品瓶中，盖好蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖，放置样品盘中待检测分析。

7.3.2缓冲液瓶的准备和摆放7.3.2.1按下图和下表加入各入口缓冲液，并用蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖盖好。

图7.1 入口缓冲液摆放图示表7.1 入口缓冲液加入体积及用途7.3.2.2按下图和下表加入各出口缓冲液，并用蓝色橡胶通用样品瓶瓶盖盖好。

图7.2 出口缓冲液摆放图示表7.2 出口缓冲液加入体积及用途7.3.3编辑方法并调用方法表7.3 电泳操作参数（高分辨率分离法）表7.4 电泳操作参数（高效分离法）7.3.4供试品检测：将供试品位置号编辑入序列表中，输入相应供试品名称与文件名称，并调用相关方法。

序列表中样品排列顺序依次为毛细管活化、空白对照、系统适用性1、供试品、系统适用性2、关机，各进样检测一次（其中系统适用性1、系统适用性2为同一管样品）；若稀释后供试品溶液终浓度小于1.0mg/ml，则可适当增加序列表中样品注射时间以增加进样量。

运行序列开始检测分析。

7.4结果分析7.4.1还原条件：按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的校正峰面积分别占所有校正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的纯度，三者之和即为产品纯度。

（注：根据样品功能决定总纯度是否包含非糖基化重链）。

7.4.2非还原条件：按面积归一化法计算，以供试品主峰的校正峰面积占所有校正峰面积之和的百分比计算单体的纯度。

7.5判定标准7.5.1空白对照判定标准：与系统适用性图谱进行比较，在供试品降解片段、单体、聚合体的迁移时间范围内，空白对照应无明显的干扰峰出现。

7.5.2系统适用性判定标准7.5.2.1非还原型电泳或还原后呈现单一主带的还原型电泳：系统适用性1与系统适用性2图谱中主峰迁移时间的极差应≤2.0min；主峰校正峰面积百分比极差应≤0.6%。

7.5.2.2还原后呈现轻链、重链的还原型电泳：系统适用性1与系统适用性2图谱中重链迁移时间的极差应≤2.0min；轻链校正峰面积百分比极差应≤0.6%；重链校正峰面积百分比极差应≤0.6%。

7.5.2.3若空白对照与系统适用性同时满足要求，则本次实验结果有效，否则实验结果无效，供试品需复检。

7.6注意事项7.6.1为保证供试品能与SDS样品缓冲液中的SDS充分结合，供试品的稀释倍数应≥2倍。

7.6.2缓冲液瓶的数量取决于样品的个数，保证每8~10个循环都能使用新的缓冲液。

7.6.3若供试品溶液的缓冲体系会干扰实验结果（如纯化中间样品），可用截距为10kD的超滤管置换缓冲体系后，再进行样品检测。

如果供试品初始浓度较低，可用截距为10kD的超滤管进行超滤浓缩，使终浓度接近2.0mg/ml。

7.6.4依据进样口离检查窗口的距离，分离方法分为高分辨率方法和高效分离方法。

在高分辨率方法中，将样品放置在左侧样品托盘中，入口缓冲液放置在左侧缓冲液托盘，出口缓冲液放置在右侧缓冲液托盘；在高效分离方法中，将样品放置在右侧样品托盘中，入口缓冲液和出口缓冲液互换位置。

7.6.5根据分子量大小选择高分辨率方法和高效分离方法，建议分子量约为30~70kD的供试品选择高分辨率方法，分子量大于70kD的供试品选择高效方法。

具体选用何种分离方法见各项目下规定。

7.6.6方法中各参数，如还原、非还原处理时孵育温度、孵育时间等，可依据各项目在该方法下的验证结果进行调整。

8相关文件————9参考文献9.1BECKMAN COULTER. PA 800plus Pharmaceutical Analysis System: SDS-MW Analysis [M]. B25803AA, January 20139.2BECKMAN COULTER. PA 800plus Pharmaceutical Analysis System: IgG Purity/Heterogeneity Assay [M]. B25801AA, January 20139.3《中国药典》2015年版，通则3127 “单抗分子大小变异体测定法（CE-SDS 法）”10流程图————11附录十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳法（CE-SDS法）测定记录一、实验材料1、试药与试液2、仪器与用具二、操作步骤1、待测样品稀释□ 空白对照：取缓冲液μl，加入稀释液μl，混匀，稀释倍数为倍。

□ 系统适用性：样品初始浓度为mg/ml，取对照品μl，加入稀释液μl，混匀，稀释倍数为倍，稀释后终浓度为mg/ml。

□ 原液：原液蛋白质初始浓度为mg/ml，取待测原液μl，加入稀释液μl，混匀，稀释倍数为倍，稀释后终浓度为mg/ml。

□成品（液体制剂）：成品标示量为，取待测成品μl，加入稀释液μl，混匀，稀释倍数为倍，稀释后终浓度为mg/ml。

□成品（冻干制剂）：成品标示量为，取成品用ml/瓶的注射用水复溶。

取复溶后成品μl，加入稀释液μl，混匀，稀释倍数为倍，稀释后终浓度为mg/ml。

□其它：2、供试品溶液制备□非还原供试品溶液制备：分别取稀释后样品溶液各μl，加入10kDa Internal Standard μl，再加入0.25mmol/L碘乙酰胺水溶液μl，涡旋混匀后在℃孵育分钟。

□还原供试品溶液制备：分别取稀释后样品溶液各μl，加入10kDaInternal Standard μl，再加入2-巯基乙醇μl，涡旋混匀后供试品溶液在℃孵育分钟。