细胞凋亡与细胞增殖的调节机制

维普资讯 郭艳红，等增殖抑制基因诱导血管平滑肌细胞凋亡　・３９５・　

径中具有一定的作用。本研究通过腺病毒介导的大　

鼠ＨＳＧ基因转染血管平滑肌细胞，观察对ＶＳＭＣ凋　

亡的作用，并探讨其可能的机制。　

１材料与方法　

１．１材料　

携带绿色荧光蛋白基因（ＡｄＧＦＰ）的对照腺病　

毒载体和携带大鼠ＨＳＧ编码序列腺病毒载体　

（ＡｄＨＳＧ）由北京大学医学部心血管所本课题组构　

建　，经ＰＣＲ和测序鉴定，载体中含有的外源基因　

片段序列完全正确。抗ＨＳＧ多克隆抗体、抗细胞色　

素Ｃ抗体、抗Ｂｃｌ－２和抗Ｂａｘ抗体购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公　

司；抗平滑肌Ｃｔ一肌动蛋白（ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｏＬ—ａｃｔｉｎ，ｏＬ—　

ＳＭＡ）单克隆抗体购自Ｓｉｇｍａ公司；ｃａｓｐａｓｅ一３活性检　

测试剂盒购自ＢＤ公司；其他试剂采用国产或进口　

分析纯试剂。　

１．２细胞培养和转染腺病毒　

采用组织块种植法进行大鼠胸主动脉ＶＳＭＣ培　

养　。用含有１０％（体积分数）胎牛血清（ｆａｔａｌ　ｂｏ—　

ｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基　

（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）在３７　

℃、含５％（体积分数）ＣＯ　、湿度恒定的培养箱中传　

代培养，实验用第３～８代细胞。　

实验分为３组：未感染腺病毒对照组（ｕｎｉｂｆｅｃｔ—　

ｅｄ组）、ＡｄＧＦＰ组和ＡｄＨＳＧ组。接种细胞２４　ｈ后，　

更换为含０．５％（体积分数）ＦＢＳ的ＤＭＥＭ，按１００　

感染复数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ）感染腺病毒　

载体，２　ｈ后弃含病毒的培养液，换含０．５％（体积分　

数）ＦＢＳ的ＤＭＥＭ继续培养至相应时间点。　

１．３转染ＨＳＧ对平滑肌细胞凋亡的影响　

１．３．１流式细胞仪测定细胞感染腺病毒２４　ｈ，４８　

ｈ和７２　ｈ后收集细胞加入ＲＮＡ酶，在３７℃孵育３０　

交通医学2018年第32卷第2期MedJofCommunications,2018,Vol.32.No.2

*[基金项目]江苏省卫生厅医学创新团队与领军人才项目（LJ201136）。**[作者简介]吴蕾蕾，女，汉族，江苏盐城人，生于1991年12月，研究生在读。研究方向：白血病和再障。咱文章编号暂1006-2440渊2018冤02-0103-04

慢性髓细胞白血病（CML）是克隆性骨髓增生性

疾病，其特征在于第9号和第22号染色体长臂断

裂、平行交叉易位，产生Ph染色体，导致具有酪氨酸

激酶活性、促进髓系细胞增殖失控的BCR-ABL融

合蛋白形成[1]。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被认为是CML治疗的金标准，其中甲磺酸伊马替尼（IM）可使80豫初发CML患者获得完全细胞遗传学和血液学

反应。然而，随着TKIs的广泛应用，耐药问题越来越

严重，阻碍了疗效，使得加速期或急变期患者增加，20%耀25豫IM治疗患者中可观察到IM耐药和疾病

进行性进展的分子学证据[2-3]。

蛋白质泛素化在各种细胞进程中起重要作用。Triad1调节K562细胞增殖尧凋亡和耐药研究*

吴蕾蕾**袁徐亚袁刘红

渊南通大学附属医院血液内科袁江苏226001冤

[摘要]目的院研究Triad1对慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562增殖和凋亡的作用以及与伊马替尼（IM）

耐药的关系。方法院将K562细胞进行血清饥饿培养，流式细胞仪检测细胞周期变化，蛋白免疫印迹法检测PCNA等增殖相关蛋白的表达。shRNA干扰K562细胞后细胞周期和凋亡的变化。构建耐药细胞K562R，蛋白免疫印迹法检测K562和K562R细胞中Triad1以及凋亡相关蛋白的表达。结果院（1）血清饥饿培养后K562细胞阻滞在G0/G1期，恢复

血清培养后随着K562细胞增殖，Triad1表达减少，而PCNA等蛋白表达增加。（2）干扰Triad1表达后，K562细胞增殖能力增强，G1期细胞减少。（3）K562R细胞Triad1的表达下降，凋亡相关蛋白表达降低。结论院Triad1通过调节细胞周期来调节K562细胞的增殖，干扰Triad1可促进K562细胞增殖，凋亡减少，Triad1表达下降可能与K562细胞耐药相关。[关键词]慢性髓细胞白血病；K562细胞；Triad1；增殖；凋亡；耐药[中图分类号]R733.7[文献标志码]A

沙蟾毒精对骨肉瘤Ｕ２ＯＳ细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制

方硕ꎬ余铃ꎬ郭卫春武汉大学人民医院ꎬ武汉４３００６０

摘要:目的　观察沙蟾毒精对人骨肉瘤细胞系Ｕ２ＯＳ增殖、凋亡、侵袭的影响ꎬ并探讨其作用机制ꎮ方法　以人骨肉瘤细胞系Ｕ２ＯＳ作为研究对象ꎬ采用ＣＣＫ￣８法检测不同浓度(０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｎｍｏｌ/Ｌ)沙蟾毒精对Ｕ２ＯＳ细胞增殖的影响ꎬ并筛选出合适给药浓度进行后续实验ꎻ采用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色ꎬ观察Ｕ２ＯＳ细胞凋亡的形态学变化ꎻ采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测沙蟾毒精对Ｕ２ＯＳ细胞侵袭能力的影响ꎻ采用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测沙蟾毒精对Ｕ２ＯＳ细胞凋亡相关基因(Ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ￣３)、抗凋亡相关基因(Ｂｃｌ￣２)及侵袭相关基因(ＭＭＰ￣２、ＭＭＰ￣９)ｍＲＮＡ表达的影响ꎮ结果　ＣＣＫ￣８细胞毒性实验表明ꎬ随着沙蟾毒精浓度升高ꎬ其对Ｕ２ＯＳ细胞的抑制率逐渐增加(Ｐ均<０.０５)ꎮＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色结果显示ꎬ５０、１００、１５０ｎｍｏｌ/Ｌ沙蟾毒精处理细胞数量减少且出现核固缩、碎裂和凋亡小体形成ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验结果显示ꎬ随沙蟾毒精(０、５０、１００、１５０ｎｍｏｌ/Ｌ)浓度升高ꎬＵ２ＯＳ细胞透膜数逐渐减少(Ｐ均<０.０５)ꎮ与０ｎｍｏｌ/Ｌ相比ꎬ５０、１００、１５０ｎｍｏｌ/Ｌ沙蟾毒精处理细胞后Ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ￣３ｍＲ￣ＮＡ表达增加ꎬＢｃｌ￣２、ＭＭＰ￣２、ＭＭＰ￣９ｍＲＮＡ表达减少(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论　沙蟾毒精能抑制Ｕ２ＯＳ细胞增殖ꎬ诱导细胞凋亡ꎬ其机制与促进Ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ￣３表达和抑制Ｂｃｌ￣２表达有关ꎻ能抑制细胞侵袭ꎬ其机制与抑制ＭＭＰ￣２和ＭＭＰ￣９表达有关ꎮ 关键词:骨肉瘤ꎻ沙蟾毒精ꎻ细胞凋亡ꎻ细胞侵袭ꎻ细胞转移 ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.１０.０１１ 中图分类号:Ｒ７３８.１ 文献标志码:Ａ 文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)１０￣００４５￣０４

山东医药２０１０年第５０卷第３ｌ期　ＳＣＨ６６３３６对胃癌细胞增殖和凋亡的　影响及作用机制　刘安玲　，郑航。　（１南方医科大学基因工程研究学院，广州５１０５１５；２南方医科大学附属南方医院）　摘要：目的探讨法尼基转移酶抑制剂（Ｆｒｌｓ）ＳＣＨ６６３３６对胃癌ＳＧＣ￣９０１与ＭＧＣ一８０３细胞增殖、凋亡的影响　及机制。方法取对数生长期胃癌ＳＧＣ￣９０１与ＭＧＣ一８０３细胞，分为实验组和对照组，实验组加入ＳＣＨ６６３３６使终　浓度分别为０．１、０．３、１．０、３．０　Ｍ，对照组加入含等体积ＤＭＳＯ的培养基，每组设３个复孔。ＭＴｒ法检测各组细胞　增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期与细胞凋亡率，Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｏｔ法检测细胞中核糖体蛋白Ｓ６的磷酸化（￥２３５／　２３６）、细胞周期素Ｄ１（ｃｙｃ￣ｎ　Ｄ１）与活化的Ｃａｓｐａｓｅ一３表达情况。结果与对照组比较，ＳＣＨ６６３３６作用后ＳＧＣＷ９０１　与ＭＧＣ￣０３细胞抑制率及凋亡率明显升高，呈Ｇｏ／Ｇ，细胞周期阻滞，ｃｙｃ￣ｎ　Ｄ１与ｓ６磷酸化表达明显降低、活化的　Ｃａｓｐａｓｅ＿３表达升高（Ｐ＜０．０５），且呈时间及剂量依赖性。结论ＳＣＨ６６３３６对ＳＧＣ￣９０１与ＭＧＣ一８０３胃癌细胞具有　增殖抑制和凋亡诱导作用，其机制可能为抑制Ｓ６的活化、下调ｃｙｅｈｎ　Ｄ１表达、激活ｃａｓｐａｓｅ－３依赖的凋亡通路。　关键词：法尼基转移酶抑制剂；胃肿瘤，胃癌；细胞增殖；细胞凋亡　中图分类号：Ｒ７３７．９　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００２￣６６Ｘ（２０１０）３１－００４３￣３　最近研究发现，法尼基转移酶抑制剂（ｇｒｌｓ）可　通过抑制促癌蛋白Ｒａｓ的活性及细胞内其他靶分　子，在多种肿瘤的治疗中有效…。但其对胃癌细胞　的影响鲜见报道。２００８年ｌ０月～２００９年１Ｏ月，我　们观察了ＦＴＩｓ　ＳＣＨ６６３３６（以下简称ＳＣＨ）对胃癌细　胞ＳＧＣ．７９０１与ＭＧＣ。８０３增殖、凋亡的影响，现探讨　其作用机制。　１材料与方法　１．１材料ＳＣＨ购自Ｓｃｈｅ６ｎｇ　Ｐｌｏｕｇｈ　Ｉｎｃ．（Ｋｅｎ—　ｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ），以ＤＭＳＯ溶解。ＤＭＥＭ培养　基（含超级新生小牛血清）购自Ｇｉｂｃｏ公司。Ｐｈｏｓ—　ｐｈｏ．Ｓ６（￥２３５／２３６）、活化的Ｃａｓｐａｓｅ一３、细胞周期素　ＤＩ（ｃｙｃｌｉｎ　ＤＩ）抗体购自Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；　四氮唑蓝（Ｍ，ｒＩ’）是ＡＭＲＥＳＯ产品；其余试剂均为国　产分析纯。人胃癌细胞株ＳＧＣ￣９０１与ＭＧＣ一８０３购　自上海细胞库。ＣＯ　培养箱；流式细胞仪。　１．２实验方法　１．２．１　细胞培养及干预用ＤＭＥＭ培养液于３７　ｏＣ、５％ＣＯ　条件下培养，每３　ｄ传代１次。　１．２．２　ＳＣＨ干预及细胞增殖抑制率检测取对数　生长期ＳＧＣ一７９０１及ＭＧＣ一８０３细胞，调整密度为２　ｘ　１０　／ｍｌ，接种于９６孔板中，１２　ｈ后分为两组，实验组　加入ＳＣＨ使终摩尔浓度分别为０．１、０．３、１．０、３．０　Ｍ，阴性对照组加人等体积含ＤＭＳＯ的培养基，每　基金项目：囤家自然科学基金资助项目（３Ｏ９ｏ０５５５）。　组设３个复孔，分别培养３６、７２　ｈ。按Ｍｈ　ｒ法测得　Ａ值，重复６次。计算肿瘤细胞生长抑制率（ＩＲ），　ＩＲ＝［（Ａ对照组一Ａ实验组）／Ａ对照组］Ｘ　１００％。　１．２．３　ＳＣＨ干预及细胞周期与凋亡率检测　将　ＳＧＣ￣９０１与ＭＧＣ￣０３细胞接种于６孔板内。测定　细胞周期时，按Ｉ．２．４处理方法加入ＳＣＨ，４８　ｈ后收　获细胞；测定细胞凋亡时，细胞置于ＤＭＥＭ培养基　中，ＳＣＨ处理２４　ｈ后收获细胞。染色后流式细胞术　分析细胞周期，计算凋亡率。　１．２．５　ＳＣＨ干预及Ｓ６磷酸化（￥２３５／２３６）、ｃｙｃｆｉｎ　Ｄ１与Ｃａｓｐａｓｅ－３表达测定　参照文献　Ｊ，胃癌ＳＧＣ一　７９０１、ＭＧＣ一８０３细胞接种于６孔板内，分别加入终浓　度为０．１、０．３、１．０、３．０　Ｍ的ＳＣＨ处理细胞２４　ｈ　后，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测￥２３５／２３６、Ｃａｓｐａｓｅ一３、ｅｙｃｌｉｎ　Ｄｌ表达，并用Ｂａｎｄ　Ｌｅａｄｅ软件分析。　１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ　１１．２统计软件。计　量数据以　±　表示，行单因子方差分析处理，组间　比较采用Ｄｕｎｎｅｔｔ方法。检验水准　＝０．０５。　２结果　２．１　ＳＣＨ作用后胃癌细胞的生长抑制率见表ｌ。　２．２　ＳＣＨ作用后胃癌细胞的细胞周期见表２。　２．３　ＳＣＨ作用２４　ｈ后胃癌细胞的细胞凋亡率见　表３。　２．４　ＳＣＨ作用后胃癌细胞￥２３５／２３６、ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１与　ｃａｓｐａｓｅ一３表达见表４。　３讨论