国外医学分子生物学舟册２００２年第２４卷第１期 多基因共表达载体的构建策略 曹慧青综述丁金风审阅 ： 主 盖 分子 学中心ｃ北京．１０００３７） 中国协和医科大学阜外心血管病医院 ・综 述・ 摘要于同一载体上同时表达多个外源基因在生物学领域中有广泛的应用价值，尤其在针对疾病发生发展的 各个环节设计的联合基因治疗方案中，构建合适的载体获得多个外源基因的高效转移与表达具有重要意义。目前 可提供的载体难以满足过一要求。近年来在多顺反子表达载体的构建策略方面有许多新的进展，本文拟对多基因 共表达载体的构建策略予以总结和阐述 关键词基因表达调控；遗传载体 在细胞或整体水平转移外源基因进行遗传学改 造、修饰是目前基因治疗的重要方式 同时转移并表 达多个外源基因在基因治疗领域有重要的应用价 值。主要采取两种途径：一是多个携带不同基因的独 立载体系统同时转染靶细胞，优点是可以自由调节 各表达载体的比例，对于包装容量小的载体如ＡＡＶ 也可通过多个载体的共同感染在同一细胞内表达多 个基因，但是效率太低 ］。二是在同一载体上构建、 表达多个基因。低效的基因转移过程是基因治疗的 瓶颈。构建多基因表达载体可提高转移及表达效率。 共表达主要应用于①表达异源多聚体蛋白的亚单 位，如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子 等；②同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以 取得联合或协同的作用，如原癌基因、抗血管生成基 因、自杀基因等 尤其是自杀基因及其与免疫活性基 因的联用已在协同抗肿瘤的研究中取得了重要进 展。大量的研究表明，联合应用不同治疗基因可以产 生较单基因更有效的作用 现将多顺反子载体构建 策略概括如下： １构建多启动子表达载体 带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个 载体上。转录出多种不同的ｍＲＮＡ并翻译出不同的 蛋白。这种方式简便、可靠。是目前最常用的构建方 式（图１．１）。不足之处是内部启动子占据载体上有 限的克隆空间 更重要的是存在启动子间的干扰现 象，如在双启动子逆转录病毒载体中，一个外源基因 的表达经常会在另一个基因表达时受抑制，而且位 于３ 端启动子下游的基因较位于５ 端启动子的基 因更容易受这种影响口］。被抑制的程度与启动子的 强度及所处的位置有关 可能的机翩是：激活的启动 子相应转录复合物的形成改变了周围染色质结构， 影响了其他转录复合物的形成。也有人认为取决于 甲基化作用或病毒载体的整合位点 这种抑制作用 不是绝对的。有时染色质结构的改变也会导致两个 启动子同时高效转录。这种抑翩作用的程度在不同 的启动子、不同的靶细胞甚至不同的细胞克隆池各 不相同 启动子抑制与重排造成不同基因表达水平 的不一致。在含３个启动子的多基因质粒表达载体 中存在同样的现象，但两个启动子头一尾相接时可避 免基因表达的下调，证明这是一种腰式作用０］。 ２构建剪切载体 利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供 体／受体位点（ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ），通过剪切初始转录本，形 成不同的ｍＲＮＡ，分别表达两个基因（图１．２）。这一 策略模拟了ｅｎｖ基因在逆转录病毒中的表达过程。 在双基因剪切载体中，位于５ 端的基因表达产物来 源于未剪切的ｍＲＮＡ，３ 端的基因表达产物来源于 剪切了的ｍＲＮＡ。一般一个基因的表达是以牺牲另 一个基因的表达效率为代价的。而且剪切效率很难 预测，与该位点的周围序列相关。在提供了剪切受体 序列的双表达载体上，如果使两个外源基因的产量 最大，必须有５Ｏ 的ｍＲＮＡ被剪切，即实际每个基 因的表达量只是期望值（不发生剪切）的一半。由于 可变剪切的调节机制尚不清楚，使剪切和不剪切的 发生比例如此理想是不太可能的。因此两基因的表 达效率很不稳定。在表达ｈｙｇｒｏ和ｎｅ０基因的逆转 ●●● ．＿＿■ｌ＿ ● 一 维普资讯 ・２・ 录病毒剪切载体中，两基因位置互换可使其最终的 病毒滴度相差５０倍 ］。而且，潜在的剪切供体序列 被激活可能导致载体序列的删除。目前这类载体较 少使用。 ３表达融合基因 两基因用连接子（１ｉｎｋｅｒ）或直接相连，使用同一 个开放阅读框，翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋 白分子（图１．３）。一般的方法是将第一个基因的终 止密码突变或删除，使其读码框与第二个基困的起 始密码或５ ＵＴＲ相连并能正确通读。终止密码与 起始密码之问的核苷酸所编码的氨基酸序列即为连 接子，多选择为中性疏水氨基酸。适当的连接子有利 于两蛋白的正确折叠及产生各自独立的功能。连接 子的设计方法多种多样。将自杀基因单纯疱疹病毒 胸苷激酶（Ｈｓｖ—ＴＫ）融合于大肠杆菌的胞嘧啶脱胺 酶（Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ）的Ｃ末端时，ＴＫ基因的５ ＵＴＲ及 ＣＤ基因的３ ＵＴＲ通过ＰＣＲ突变为编码甘氨酸的 序列，产生以１０个多聚甘氨酸为连接子的融合蛋 白 ］。而当ＴＫ融合于绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的ｃ末 端时，其５ ＵＴＲ的７１个核苷酸直接与ＧＦＰ的末位 碱基相接，翻译成２４个氨基酸的连接子 ］，两种方 法都成功地产生了具备双基因功能的融合蛋白。这 是目前真正实现翻译水平等量表达的方法。常用于 阳性／阴性双选择标记载体或筛选标记／报告基因载 体的构建，可以有效地保留或杀伤被转导的细胞。如 ＨＳＶ—ＴＫ／ｎｅｏ、ＨＳＶ—ＴＫ／ＧＦＰ等［ 。这种方法的主 要问题是：①很可能由于构象的改变使其中一个或 两个基因的功能受到影响；②若两基因产物有不同 的细胞定位，也会影响基困的正常功能。即基因的功 能并不平衡，基本上只用于两个基困的共表达。 ４基因之间以ＩＲＥＳ序列连接 内部核糖体进人位点（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥｓ）序列来源于某些病毒和细胞的ｍＲＮＡ ５ 端的一段非翻译区。在上游启动子的控制下，该序 列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的 方式启动远端ｍＲＮＡ的翻译，从而在同一转录本上 翻译出不同的蛋白（图１．４）。ＩＲＥＳ元件多具有高级 结构，富含ＧＣ。不同来源的ＩＲＥＳ序列组成不同，长 度各异，在不同细胞类型中的作用也各有特点。来源 于脑心肌炎病毒ＥＭＣＶ的该序列又被称为不依赖 帽的翻译增强子（ｃａｐ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎ ｈａｎｅｅｒ，ＣＩＴＥ），在大部分细胞中可直接招募核糖体 起始其下游顺反子的翻译。但对起始密码的位置要 国外医学分子生物学分册２００２年第２４卷第１期 求严格．只有该序列中的第１１个可作为起始密码， 这增加了载体构建的难度。而来源于脊髓灰质炎或 口蹄疫病毒的ＩＲＥＳ序列对其后的任一个符合 ＫＯＺＡＫ序列的ＡＵＧ均可有效地起始翻译，因而 得到更广泛的应用。应注意当ＩＲＥＳ序列置于两个 顺反子之问时，它与第一个顺反子的终止密码的最 佳距离为８０ ｂｐ。少于４０ ｂｐ或多于３Ｏ０～４００ ｂｐ会 大大降低ＩＲＥＳ序列的翻译效率０］。采用ＩＲＥＳ元件 代替内部启动子克服了启动子间的抑制现象，是近 年来多基困表达的重要方法，尤其是当目的基因与 其后的选择标记基因共同翻译时。传统的载体中目 的基因和筛选基困采用各自独立的表达盒，选择压 力施加在抗药基因的表达上，困此筛选出克隆的目 的基因的表达往往不高，甚至检测不到。而采用 ＩＲＥＳ序列连接两基困的载体，几乎所有筛选出的 存活克隆均可表达目的基因。而且由于核糖体既可 以进人双顺反子ｍＲＮＡ的５ 端也可以在ＩＲＥＳ的 位置启动翻译，因此对于抗生索的选择标记而言，选 择压力是加在整个表达盒上的，加大抗生素的剂量 可同时获得目的基因的稳定高表达。简化了传统的 双启动子表达盒模式繁琐的阳性克隆筛选过程。荆 兵等构建了分别以ＬＴＲ、ＳＶ４０和ＬＴＲ、ＩＲＥＳ启动 的表达ＧＦＰ和新霉素抗性基因（ｎｅｏ）的两个逆转录 病毒载体，发现在无Ｇ４１８筛选时，两者的ＧＦＰ阳 性率相似，约２６ ，经Ｇ４１８筛选后，双启动子组的 存活克隆中５４ 表达ＧＦＰ，ＩＲＥＳ组则高达９８ 。 说明内部启动子或ＩＲＥＳ序列的上、下游基因都存 在不平衡表达，但在选择压力下ＩＲＥＳ序列排除不 平衡表达的能力更强 ］。ＩＲＥｓ序列在三顺反子构建 中具有同样的优势，如包括ＬＴＲ、ＳＶ４０、ＨＳＶ三个 启动子的逆转录病毒载体，靶基困ＲＮＡ的表达水 平为４２；６：１＿ｌ０＿。使用两个ＩＲＥＳ的三基因载体可 避免这种转录水平的相互影响，产生高滴度病毒。由 于多于一个ＩＲＥＳ序列会由于同源重组等造成载体 不稳定，因此，当用于两个以上的多顺反子构建时， 最好使用来源于不同病毒的ＩＲＥＳ。 ＩＲＥＳ相连的基因虽然转录时ｍＲＮＡ是等量 的，但其翻译过程是独立的，研究发现以ＩＲＥＳ启动 的翻译效率较帽依赖的翻译效率低。在双顺反子载 体中，置于ＩＲＥＳ下游外源基困的表达量是其上游 帽启动翻译基困的２０ ～５０ ，即翻译水平的表达 并不等量＿］ 。因此构建时必须考虑外源基因的位置 影响。ＩＲＥｓ序列还可应用于酵母双杂交，基因诱补 技术等。
LncRNA表达载体的构建
通过载体实现lncRNA的过表达原则上将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现，然而，有些lncRNA很大或者全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。
1. lncRNA定位在蛋白编码基因启动子区域
1.1 定位在蛋白编码基因启动子区域并同向转录的lncRNA
该类lncRNA往往与启动子区域的转录因子相互作用，在转录前水平调控基因的表达，在构建该类lncRNA表达载体时，往往将lncRNA在蛋白编码基因启动子区域的部分或者更长的序列定向克隆到表达载体实现lncRNA的过表达。
1.2 定位在蛋白编码基因启动子区域并反向转录的lncRNA
该类lncRNA往往通过对蛋白编码基因的启动子区域进行表观遗传修饰，改变染色体的结构，从而调控基因的表达。在构建该类lncRNA表达载体时，往往将lncRNA在蛋白编码基因启动子区域的部分或者更长的序列定向克隆到表达载体实现lncRNA的过表达。
2. lncRNA定位在蛋白编码基因的3’-UTR区域
2.1 lncRNA通过影响microRNA的分布间接调控基因的表达
lncRNA的3’-UTR含有microRNA的结合位点，从而影响microRNA靶基因的表达。
2.2 lncRNA通过Alu element与蛋白编码基因相互作用，在staufen1等蛋白复合体的作用下，降解蛋白编码基因的mRNA。
2.3 lncRNA影响mRNA的可变剪接
将蛋白编码基因3’-UTR 对应的lncRNA序列或更长部分定向克隆到表达载体实现lncRNA的过表达。
3. lncRNA定位在基因间区域
该类lncRNA往往与染色体的结构有关，比如异染色质的形成等。
因此，对于lncRNA的研究，采用siRNA沉默其表达进而研究其功能是广泛采用的。
【材料1】[材料id:169335, 题目id:1568255]
（二）回答下列有关细胞结构与细胞分裂的问题。（10分）
在哺乳动物细胞有丝分裂的某个时期，一条染色体复制后，形成两条染色单体，随后一种叫动粒的蛋白质结构在着丝粒处以背对背的方式装配形成，并各自与细胞相应一极发出的纺锤丝结合。
1.图14表示某哺乳动物细胞有丝分裂形成子细胞的过程。有丝分裂中动粒指向细胞的哪一极，染色体就被这一极中心体发出的纺锤丝拉向这一极。根据图14所示有丝分裂过程中动粒的定向模式，推测分裂得到图15所示细胞的初级卵母细胞中，动粒定向模式是下列的 。（2分）
1.
【答案】
C
【解析】
由图可知，灰色染色体与白色染色体互为同源染色体，图15所示为同源染色体分别进入到两个子细胞中，表明图15所示的细胞是由初级卵母细胞经减数第一次分裂形成，而且在该过程中发生了非姐妹染色单体的交叉互换。由此推测，在初级卵母细胞中，同一染色体的姐妹染色单体上的动粒定向为同一方向，而同源染色体的动粒定向方向相反，且姐妹染色单体的颜色应该相同，故本题正确答案为C。
【题目2】[id:435965]
（8分）肠道病毒EV71为单股正链（+RNA）病毒，是引起手足口病的主要病原体之一。下面为该病毒在宿主肠道细胞内增殖的示意图。请据图分析回答：
（1）合成物质M的原料是由宿主细胞提供的_____，合成的场所是_____。过程①、②为_____。
（2）图中+RNA的功能是作为_____的模板及病毒的重要组成成分。
（3）EV71病毒感染机体后，引发的特异性免疫有_____和_____。
（4）病毒衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成，其中VP1、VP2、VP3裸露于病毒表面，而VP4包埋在衣壳内侧并与RNA连接，另外VP1不受胃液中胃酸的破坏。四种蛋白中不宜作为抗原制成疫苗的是_____，更适宜作为抗原制成口服疫苗的是_____。
延边大学医学学报２００８年３月 第３ｌ卷第１期
单链抗体Ａ ７基因真核表达载体的构建
李强，魏晶，韩晓敏，李辉，穆永佳，李红花，李英信，孟繁平
（延边大学基础医学院免疫学与病原生物学教研部，吉林延吉１３３０００） ・ ５ ・
［摘要］ ［目的］构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体Ａ ７基因的真核表达载体。为单链抗体 Ａ ７基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础．［方法］应用ＰＣＲ技术，从已构建的含有抗乙酰 胆碱受体主要免疫原区单链抗体Ａ ７基因的重组原核表达载体ｐＨＥＮ ２单链抗体Ａ ７上扩增单链抗体 Ａ ７基因并纯化。将纯化后的ＰＣＲ产物经ＥｃｏＲ Ｉ和Ａ Ⅱ双酶切后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯
． 化，再与经同样酶切并纯化的真核表达载体ｐＰＩＣ ９Ｋ连接，将其产物转化至大肠杆菌ＤＨ ５ ａ后扩增，再 用ＡｖｒＩＩ和ＥｃｏＲＩ酶切和测定序列检查ＳｃＦｖＡ ７基因插入的准确性．［结果］构建ｐＰＩＣ ９Ｋ—ＳｃＦｖＡ ７ 重组载体，经序列测定检查核苷酸序列正确，且ＳｃＦｖ Ａ ７基因准确地克隆至载体开放读码框架内． ［结论］成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体Ａ ７基因的真核表达载体． ［关键词］ 重症肌无力；抗体；真核表达载体 ［中图分类号］Ｒ ３９２．ｉ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ ｉ０００—１８２４（２００８）０１—０００５—０４
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｇｅｎｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ
ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ ７
ＬＩ Ｑｉａｎｇ，ＷＥＩ Ｊｉｎｇ，ＨＡＮ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ，ＬＩ Ｈｕｉ，ＭＵ Ｙｏｎｇ－ｊｉａ，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｈｕａ，ＬＩ Ｙｉｎｇ—ｘｉｎ，ＭＥＮＧ Ｆａｎ—ｐｉｎｇ。 （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｂｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｙａｎｊｉ １３３０００，Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：０ＢＪＥｃＴＩｙＥ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｉｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ
