基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。
美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag™、Halo Tag™、AviTag™、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。
以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。
TrxHIS
His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点：
标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能;
His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性;
His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。
可应用于多种表达系统，纯化的条件温和;
可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
Flag标签蛋白
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
LYM基因克隆构建PAbAi载体
1 / 2 I 加样
酶(HS) 0.5ul
前引物 1ul
后引物 1ul
HS(25) dNTP (2.5mM) 1ul
30s/1Kb buffer 5
DNA 1ul
灭菌水 16.5 ul
加完样后短暂离心后需将产物置于冰上数分钟后再放进PCR仪；点样时加5ul的marker，根据marker亮度来估算产物浓度。
II 目的片段回收，依据试剂盒说明书。最后一步用加热过的ddH2O溶解
III 回收的目的片段连接BD载体
1.1含pAbAi载体的质粒提取：将-80℃保存的菌液划线（AD、pAbAi涂氨苄抗性的板，BD涂卡那抗性的板），37℃培养14-16h,挑取单菌落摇菌，然后按照质粒提取试剂盒提取质粒即可，将提取的质粒置于-20℃保存。（这里的质粒可以通俗的理解为载体）
1.2对连接启动子的做单杂的载体pAbAi进行双酶切，用的是SalI和SacI, 37度酶切3个小时
20ul
1.3将双酶切产物全部跑胶，检测是否双酶切成功并回收
重点：将8管成功双酶切产物跑的胶收集到一个离心管里回收，目的是提高双酶切产物的浓度(大约30ng/ul即可用)，记得需要点未双酶切的质粒作为对照；
回收后要跑胶检测浓度：1ul双酶切产物+1ulLoading Buffer跑胶，并且15000的Marker点5ul，根据条带亮度来判断双酶切产物浓度，条带大约7.3kp大小。
双酶切产物一般-20℃放置3个月以后连接效率就降低了，所以双酶切的量要酌情控制。
如果已经有双酶切好的PAbAi载体，则不需要再做1.1-1.3的内容，直接进行1.4的操
1 基因克隆的质粒载体
在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节 质粒的一般生物学特性
一、质粒DNA
细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。
2 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC 3 DNA（图4-3）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。
第３９卷第７期
２００８年７ ｉ 一…一一…＝一＝一一：一 一一： 文章编号 １００５—９５６９（２００８）０７—００５７—０４ ３９ｆ７１：５７—６０
』ｌｌｉｙ ２００８
基因的克隆及植物表达载体的构建
于守江，王超
东北农业大学园艺学院＋哈尔滨１５００３０）
摘要：试验将从质祖ｐＢ！ｊ０上克隆得到的８ｔ基因的片段 连接到高效的植物表达栽嗨质枉ｐＢ Ｊｉ２１上，此 重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和ＰＣＲ鉴定，证明台有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功
关键词： 基因；克隆；植物表达裁体 中图分类号：Ｑ９４３ ２：￥４３ 文献标识码：Ａ
虫害一直是威胁农业生产的一个世界性问题，
使用化学杀虫剂不仅成本高 而且污染环境，因 此需采用一些新的方法来替代化学农药。利用生 物技术创造新的抗虫植物品种对农业害虫的防治、 环境保护及农业可持续发展都具有重要的意义ｌｌ】。
结球甘蓝的虫害日益猖獗，甘蓝结球后常遭到菜 青虫、小菜蛾等危害，严重地影响结球甘蓝的品 质和商品价值Ｉ 。因此，培育抗虫新品种已经变得
尤为严峻。利用生物防治、化学防治、物理防治 的方法不是污染环境就是成本太高，而利用生物 技术手段选育抗虫新品种则是防治病虫害的最经
济有效的方法 。 本试验的目的是克隆出 基因，构建一个高 效的植物表达载体，为结球甘蓝的遗传转化奠定
材料基础。
１ 材料与方法
１．１材料 １．１．１菌种与质粒 大肠杆菌菌株ＤＨ５ 、根癌农杆菌菌株ＬＢＡ ４４０４由东北农业大学园艺学院蔬菜实验室提供。 含 基因的ｐＢ１１０质粒由中国农业科学院植物 保护研究所李轶女博士馈赠。表达载体质粒ｐＢＩ
１２１由国家蔬菜与花卉工程中心赠送。用于测序 的质粒ｐｃ＿Ｔ由东北农业大学园艺学院刘守伟博
士构建。
收稿日期：２００７—０４—０９ 作者简介：干守江ｆ１９８１一），男，黑龙江人，硕士研究生，研 究方向为甘蓝生物技术。 ｝通讯作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｈａｏ５０４＠１２６．ｅｏｍ １．ｉ ２酶和生化试剂 限制性内切酶Ｂａｒｎ Ｈ Ｉ和Ｓａｃ ｊ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚
