RAPD分子标记的实验原理及操作流程
RAPD标记
RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic
DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
一、实验材料
不同来源的DNA(30-50ng/ul)。
二、实验设备
PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。
三、试剂
1、RAPD引物：购买成品或根据赛百盛（SBS）公司设计的RAPD引物序列（/pro11_1.asp）合成。
2、Taq酶
3、10xPCR 缓冲液
4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：
1. 在15ul反应体系中，加入
模板DNA 1ul (30-50ng)
RAPD引物 1ul (约5pmol)
10xPCR Buffer 1.5ul
MgCl2 1ul
dNTP 1ul
Taq酶 0.5单位（U）
加ddH2O 至 15ul
混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
2. 在PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟，
72℃ 1分钟，共40轮循环。
3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 在15ul PCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ。
种质资源分析中RFLPRAPDAFLPSSR的比较研究
种质资源分析是研究物种的遗传多样性和亲缘关系的重要手段之一、其中，RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)、RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA)、AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism) 和SSR (Simple Sequence Repeat) 是四种常用的分子标记技术。以下是对这四种技术的比较研究详解：
1.RFLP：RFLP技术是一种早期的分子标记技术，通过检测DNA的限制性内切酶切割产生的DNA片段的长度差异，从而分析基因座的多态性。RFLP技术具有高度的稳定性和可重复性，适用于分析DNA序列中的比较大的多态性位点。然而，该技术由于耗时、耗费精力和使用的放射性同位素等缺点，已逐渐被其他技术所取代。
2.RAPD：RAPD技术是一种基于随机引物扩增多态DNA片段的技术。其原理是随机应变的引物与目标DNA中的功构象区结合，经为引物扩增产物进行电泳分离后，通过比较DNA带型的差异来分析物种间的遗传关系。RAPD技术具有快速、简单和经济的优点，但因为扩增产物的非特异性和多态性，其结果存在一定的误差和不可重复性。
3.AFLP：AFLP技术是一种基于PCR扩增的多态性位点标记方法。它在RAPD的基础上引入了限制性内切酶切割，因此具有较高的清晰度和可重复性。AFLP技术在物种间遗传多样性和亲缘关系研究中广泛应用，特别适用于对有限数量的DNA样本进行分析。
4.SSR：SSR技术是一种基于PCR扩增的微卫星位点标记方法，也被称为简单重复序列标记。它通过特异性引物扩增不同物种DNA中的高度可变区域，然后利用电泳分离进行检测。SSR技术具有高度多态性、遗传稳定性和高度重复性等优点，被广泛应用于种质资源分析和分子育种。
RFLP和RAPD技术原理和操作步骤
原理：
DNA分⼦⽔准上的多态性检验测定技术是施⾏基因组研讨的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限⽌断⽚长度多态性)已被⼴泛⽤于基因组遗传图谱构建、基因定位以及有⽣命的物质⾼级演化和分类的研讨。RFLP是依据不⼀样品种（个体）基因组的限⽌性内切酶的酶切位点碱基发⽣突变，或酶切位点之间发⽣了碱基的插进去、缺失，造成酶切断⽚体积发⽣了变动，这种变动可以经过特别指定探针杂交施⾏检验测定，因此可⽐较不⼀样品种（个体）的DNA⽔准的差别（即多态性），多个探针的⽐较可以稳固建⽴有⽣命的物质的⾼级演化和分类关系。所⽤的探针为出处于同种或不⼀样种基因组DNA的克隆，位于染⾊体的不⼀样位点，因此可以作为⼀种分⼦标记(马克)，构建分⼦图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分⼦标记协同离合时，表明这个性状（基因）与分⼦标记连锁。分⼦标记与性状之间交换值的体积，即表达⽬的基因与分⼦标记之间的距离，因此可将基因定位于分⼦图谱上。分⼦标记克隆在质粒上，可以蕃息及保留。不⼀样限⽌性内切酶割切基因组DNA后，所切的断⽚类型不同，因为这个，限⽌性内切酶与分⼦标记组成不⼀样组合施⾏研讨。常⽤的限⽌性内切酶普通是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,⽽分⼦标记则有⼏个甚⾄于上千个。分⼦标记越多，则所构建的图谱就越达到最⾼限度。构建达到最⾼限度图谱是RFLP研讨的主重要的条⽬标之⼀。
使⽤随机引物扩增寻觅多态性DNA断⽚可作为分⼦标记。这种办法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞⽣的时间很短, 但因为其独有特别的检验测定DNA多态性的形式以及迅速、简单⽅便的独特的地⽅,使这个技术已渗透于基因组研讨的多种⽅⾯。该RAPD技术树⽴于PCR技术基础上,它是利⽤⼀系列(⼀般数百个)不⼀样的随机排列碱基顺着次序的寡聚核苷酸单链(⼀般为10聚体)为引物,对所研讨基因组DNA施⾏PCR扩增.聚丙烯酰胺或⽯花胶糖电泳离合,经EB染⾊或放射性⾃显影来检验测定扩增加产量物DNA断⽚的多态性,这些个扩增加产量物DNA断⽚的多态性反映了基因组相应地区范围的DNA多态性。RAPD所⽤的⼀系列引物DNA序列各不⼀,但对于任⼀特别优异的引物,它同基因组DNA序列有其特别优异的接合位点.这些个特别优异的接合位点在基因组某些地区范围内的散布如合乎PCR扩增反响的条件,即引物在模型板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在⼀定的长度范围之内,就可扩增出DNA断⽚.因为这个假如基因组在这些个地区范围发⽣DNA断⽚插进去、缺失或碱基突变就有可能造成这些个特别指定接合位点散布发⽣相应的变动,⽽使PCR产物增加、缺乏或发疏远⼦量的变更。经过对PCR产物检验测定即可检出基因组DNA的多态性。剖析时可⽤的引物数⾮常⼤,固然对每⼀个引物⽽⾔其检验测定基因组DNA多态性的地区范围是有限的,不过利⽤⼀系列引物则可以使检验测定地区范围⼏乎遮盖整个⼉基因组。因为这个RAPD可以对整个⼉基因组DNA施⾏多态性检验测定。额外，RAPD断⽚克隆后可作为RFLP的分⼦标记施⾏作图剖析。
Analysisofheavy2ion2inducedDNAstrand
breaksinplasmidpUC18
GUOHui2jun1,LIULu2xiang1,LIJia2cai2,ZHAOKui3,SUILi3,ZHAOLin2shu1,ZHAOShi2rong1
(11TheNationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovement,instituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;21InstituteofHighEnergyPhysics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China;31DepartmentofNuclearPhysics,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)Abstract:PlasmidDNAwasirradiatedorimplantedbymixedparticlefield(CR)orlithium2ion2beam
todetectstrandbreaks1Theprimaryresultsshowedthatmixedparticlefieldcouldinducesingleand
doublestrandbreakswithpositivelinear2dose2effects;mostofsequencechangesinducedbyCRwere
pointmutant1Lithium2ion2beamcouldinducestrandbreaksalso,butitwasonlyatdoseof20Gy1
胡萝卜品种鉴定的RAPD分子标记技术研究
赵 彦,陈源闽3,廉 勇,王 勇,张艳萍,李敬起
