RAPD技术

第七章 RFLP和RAPD技术

第一节 概 述

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction

Fragment Length Polymorphism，限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XbaⅠ，而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短， 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点，使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3'端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大，虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

曩用技术　文章编号：１６７４—９１４６（２０１０）０９—００９８—０２　ＲＡＰＤ分　标记技术概述　及庄用　刘晓宇　（太原市科兴中小企业科技服务中心，山西　太原０３０００６）　鬻｜　３瓶　要：　￣ＲＡＰＤ龠于标记技苯桷碌理和铰　靛点　。毫重￣ＲＡＰＤ务亍　ｊｉ末记枝朱柱植蝴　旃　的菔讯）　ｊ＊｜　：蜘　标记　分寻标记枝朱　植物遗传奄精　遗传多椿牲＊ｉ≯　誊｜　。　ｌ　叠§郜圈分类号　Ｑ’　文赫赫意　｜｜薯　ｌ｜ｔ　ＤＮＡ分子水平多态性检测技术是进行基因组研　究的基础。１９９０年，Ｗｉｌｌｉａｍｓ和Ｗｅｌｓｈ等人运用随　机引物扩增寻找的多态性ＤＮＡ片段用作分子标记。　并将此技术命名为ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｄ　ｐｏｌｙｓｎｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ），即随机扩增多态性ＤＮＡ。尽管　ＲＡＰＤ技术诞生的时间不长，但由于其丰富的ＤＮＡ　多态性及快速、简便等特点，使它成为目前植物育　种研究工作采用最多的手段。　１　ＲＡＰＤ技术原理　随机扩增多态性ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）．是以ＰＣＲ为基础．以随机的短　核苷酸序列为引物，以实验材料基因组ＤＮＡ为模　板，进行ＰＣＲ反应，找出扩增片段的多态性。由　于整个基因组存在众多反向重复序列，因此需单独　对每一随机引物进行ＰＣＲ．如果引物结合部位的核　苷酸序列发生了变化，或者扩增范围内碱基出现插　入或缺失．ＤＮＡ重排，就会导致原来结合位点的　消失或产生新的结合位点，或者使扩增片段的长度　发生改变。经琼脂糖凝胶电泳分离后通过ＥＢ染色　就检测出基因组所发生的变化　２　ＲＡＰＤ技术的优缺点　与其他分子标记技术相比，ＲＡＰＤ具有以下优　越性：ＲＡＰＤ所用引物为随机引物。一套引物可用　于不同植物基因组分析，且不需预先知道待扩增基　因的核苷酸顺序，试验费用较低。ＲＡＰＤ技术的多　态性位点是无限的，灵敏度高，能够检测出品种间　的微小差异。ＲＡＰＤ实验中所需ＤＮＡ样品量少，　纯度要求不高，实验过程中一般不需要进行Ｓｏｕｔｈ—　ｅｒｎ转移、分子杂交等一系列繁琐的程序，可一次　检测大量样品。同时，ＲＡＰＤ不需要使用同位素，　减少了对工作人员的危害。ＲＡＰＤ产物，经过克隆　和序列分析后，可作为ＲＦＬＰ和原位杂交的探针，　在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。　但ＲＡＰＤ分子标记技术也存在着一些缺点，一　是标记大多是显性标记，二是实验稳定性一般。但　许多研究表明，这些缺点是可以克服的。通过在实　验中对ＲＡＰＤ技术体系进行优化，严格控制试验条　件，并进行重复试验即可得到理想的结果。　３　ＲＡＰＤ分子标记技术在植物育种中的应用　３．１　种质资源遗传多样性的研究　植物种质资源的研究是植物品种改良、新品种　培育及遗传育种工作的物质基础。利用ＲＡＰＤ技术　能够检测植物物种的遗传多样性，研究物种间的亲　缘关系，为植物种植资源的保存、鉴定提供了有力　的工具，同时大大降低了种质资源收集和保存所需　费用，可广泛应用于种质资源的研究工作中。李勇　等利用该技术分析了２４份不同产地的金莲花种质，　结果显示，多态性位点为５５．６７％，金莲花总多样　性指数为０．１４６　０，居群内遗传多样性为０．０５９　１『１］。　依据结果推理，目前我国金莲花种质资源的遗传多　样性指数偏低，因此需要采取相应的措施，对不同　金莲花种质资源进行合理保护。　３．２构建遗传图谱　遗传图谱是遗传学研究的一个重要领域，是功　收稿日期：２０１０—０７—１５；修回日期：２０１０—０８—１７　作者简介：刘晓宇（１９８０一），男，山西晋中人，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｔａｉｙｕａｎｃｈｕａｎｇｙｅ＠１６３．ＣＯｒｎ。　｛ＳＣＩ－ＴＥＣＨ　ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ＆ＰＲＯＤＵＣＴＩＶＩＴＹ　－－　。＾。●’●。　－●’口’　ｈ‘●。Ｊ。ｄ’　ｈ‘＿。●’●一　一（）９８一ｌ一　…２～０—１０，Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ．２００

·１２６·　实用防盲技术２０１　ｌｇ－８月第６卷第３期　

相对性传人性瞳孔障碍（ＲＡＰＤ）　

张国梅　

Ｄｏｉ：１０。３９６９／ｊ．ｉｓｓｈ。１６７３－３８３５．２０１　１。０３。０１４　

光线射眼时引起瞳孔缩小，称光反射。分直　接、间接光反射两种。以光照射一眼，引起被照　

射眼瞳孔缩小称直接光反射。光照射一眼，引起　另眼瞳孔同时缩小称间接光反射。　

瞳孔光反射异常可分为传出性瞳孔障碍和　

传人性瞳孔障碍，可通过双眼的直接、间接光反　射检查发现。传出性瞳孔障碍是由瞳孔反射弧　运动支异常所致，表现为光照射任何一眼和集　

合反射时瞳孔的收缩迟钝或消失，而传人性瞳　

孔障碍是因反射弧感觉支异常所致，表现为光　照射患眼时双侧瞳孔收缩迟钝或消失。绝对传　

人性瞳孔障碍眼（盲眼），光照射患眼时瞳孔反应　完全消失，而更为常见的是相对传人性瞳孔障　

碍，亦称Ｍａｒｃｕｓ—Ｇｕｎｎ瞳孔，可通过交替光照试　

验检查发现。　传人性瞳孔障碍是指位于视网膜、视神　

经、视交叉、视束或中脑顶盖前区的病变，例　如视网膜脱离、视神经炎、压迫性视神经病变　

等，使光刺激信号传人受阻，不能正常传至瞳　孔运动中枢，导致瞳孔对光反应下降。若仅一　眼存在传人性瞳孔障碍而另眼正常，或两眼传　

人性瞳孔障碍程度不对称，称为相对性瞳孔传　入障碍（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｕｐｉｌｌａｒｙ　ｄｅｆｅｃｔ，ＲＡＰＤ）ｏ　

其特征性检查是，用相同光线交替照射双眼，一　眼相对于另眼的瞳孔对光收缩幅度下降、速度减　慢或继之有再散大。　

一、瞳孔对光反射弧　

光反射路径分传人和传出径路。　传人径路：光照一眼后，除引起视觉冲动　

作者单位：２３０００１安徽省医科大学附属安徽省立　医院眼科　外，也同时引起光反射传人纤维的冲动。开始光　反射纤维和视觉纤维伴行人颅内，经视交叉时一　部分纤维交叉到对侧视柬，另一部分纤维不交叉　进入同侧视束。当接近外侧膝状体时，光反射传　

人纤维离开视束，经四叠体上丘臂进入中脑顶盖　前区，终止于顶盖前核。在核内交换神经元后，　

安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００８，３６（２３）：９８７３—９８７４，９９７２　责任编辑张彩丽　责任校对马君叶　

ＲＡＰＤ分析技术在小麦分子育种中的应用　

李静雯，欧巧明，张正英　（甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃兰州７３００７ｏ）　

摘要针对ＲＡＰＤ分析技术在小麦分子育种研究中所出现的具体问题，对其在小麦遗传变异分析、目的基因的标记与定位、外源染色体　

的检测、品种鉴定、遗传图谱的构建、近缘种属间的遗传关系与遗传多样性研究等方面的最新进展和应用进行了综述，为小麦分子标记　

辅助选择育种等相关研究提供有益的借鉴。　

关键词ＲＡＰＤ；小麦；分子育种；分子标记　

中图分类号￥５１２　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００８）２３—０９８７３—０２　

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＡＰＤ　ｉｎ　Ｗｈｅａｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　

ＬＩ　Ｊｉｎｇ－ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇ６ｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ　７３００７０）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｒｅｔｅ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＰＤ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ．ｔｈｅ　ｌａｔｅｓｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　

ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，山ｅ　ｍａｒｋｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ｇｅｎｅ．ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒｅｅｄ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｐ，ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ，　ｗｈｉｃｈ　ｏｆｆｅｒｅｄ　ｕｓｅｆｕｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｗｈｅａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．