超声波法提取黑木耳中粗多糖的工艺研究

超声波法提取黑木耳中粗多糖的工艺研究

作者：宗丽娜 李成帅

来源：《当代化工》2020年第06期

Optimization of Ultrasonic Extraction of CrudePolysaccharide From Auricularia Auricular

ZONG Li-na， LI Cheng-shuai

（School of Chemical Engineering， Shengli College， China University of Petroleum，

Dongying Shandong 257061， China）

黑木耳，别名黑菜，属层菌纲木耳科，可药食两用。黑木耳既有野生的又有人工培植的，主要分布在我国的华北、东北、西南、中南及沿海各省份，营养价值很高。黑木耳中富含多种活性成分，如胶原、多糖、木耳黑色素、发酵素、卵磷脂、植物碱等[1]。多糖是黑木耳中主要活性成分[2-3]，具有很多药理作用，能预防高血压、高血脂、冠心病、抗血栓、抗衰老、调节免疫、抗癌防癌等作用[4-5]。是目前广受关注的天然活性化合物。

目前，黑木耳的应用主要是鲜食或干燥后销售于市场，对黑木耳中生物活性成分的提取研究还处于初级阶段，因此充分利用现有的黑木耳资源，对其多糖进行充分提取应用具有深远的意义。现在提取的黑木耳多糖多采用热水浸提[6-7]，该法对设备要求低、成本低，但是耗时长，液料比大，易造成能耗和资源的浪费，同时提取率也不高，不能满足人们的需求。因此如何有效的提高黑木耳多糖的提取率成为社会的迫切要求。近年来，超声波提取法[8-12]被广泛的应用于中草药的提取中，由于超声波作用所引起的振动和空化效应较强烈，破坏了植物体细胞壁，从而使得溶剂对细胞的穿透力增加，细胞中的有效成分溶出加速[13]。其特点是提取时间很短、提取效率高、溶剂使用量少。为了达到更好的提取效果，本文采用复合提取法对黑木耳中粗多糖进行提取，并通过响应面分析法设计并验证了较优的提取工艺，从而为黑木耳中多糖提取物的工业化生产提供理论依据。

黑木耳：产地东北，市售。

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醚、丙酮、石油醚、乙醇：国药试剂有限公司（AR.）。

FW-100小型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;SK7210HP数控超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司生产;752N紫外可见分光光度计、FA2004精密电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司生产;试管架、10 mL具塞试管、烧杯、容量瓶。

1.3.1 粗多糖的提取工艺流程

洗净的黑木耳干燥→粉碎（过150目筛（孔径0.106 mm））→蒸馏水→超声浸提→水浴浸提→4 500 r/min离心15 min→上清液→等量乙醇→静置过夜→4 500 r·min-1离心10 min→沉淀→丙酮和石油醚洗涤→干燥→黑木耳粗多糖提取物。

1.3.2 标准曲线[14，15] 本实验中采用苯酚-硫酸法测量黑木耳超声提取液中多糖含量。

1）准确称取烘干至恒重的葡萄糖粉末0.5 g于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水溶解定容，再取出1 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容得到0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

2）用移液管分别吸取0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的葡萄糖标准溶液于10 mL具塞试管中，分别加蒸馏水补至2 mL，然后加入1 mL 质量分数为6%的苯酚（现配）后混匀，缓慢加入5 mL浓硫酸，震荡混匀，沸水浴显色，15 min冷却后于波长490

nm处测量吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，得标准曲线。其线性回归方程为y = 0.017 8x + 0.012 3，相关系数R2 = 0.999 1，线性关系良好。

1.3.3 黑木耳中粗糖提取率的计算

吸取粗多糖提取物，溶解定容至100 mL，得黑木耳粗多糖溶液，重复试验步骤1.3.2的操作，测定不同的黑木耳粗多糖溶液的吸光度，由回归方程得到黑木耳粗多糖的浓度（mg·mL-1），进一步计算多糖提取率。

1.3.4 单因素实验

称取黑木耳粗粉，采用超声波辅助热水法提取粗多糖，各单因素变量分别设置为：超声功率（100、200、300、400、500 W）;液料比（20、30、40、50、60 mL·g-1）;超声时间（15、25、35、45、50 min）;超声水浴温度（40、50、60、70、80 ℃），分析各因素对提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

以单因素试验为基础，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，以超声功率（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声水浴温度（D）为自变量，粗多糖提取率为响应值Y（%），设计四因素三水平分析响应面试验，试验因素与水平见表1。

2 结果与讨论

2.1.1 超声功率对粗多糖提取率的影响

超声功率对黑木耳中粗多糖的提取率影响如图1所示。

從图1可以看出，粗多糖提取率随超声功率的增大而上升，当超声功率达到300 W时粗多糖提取率最大，为12.6%。继续提高超声功率，提取率下降，这主要是因为经过超声处理，黑木耳的细胞壁被有效的破坏，促使细胞内含的粗多糖得以释放，功率越强，细胞的破坏效果越明显;当超声波功率进一步升高后，还会黑木耳多糖的糖苷键造成破坏，导致多糖的降解，多糖的提取率降低。故选择200 ～ 400 W的超声功率进行BoxBehnken试验设计。

2.1.2 液料比对粗多糖提取的影响

液料比对黑木耳中粗多糖的提取率的影响如图2所示。

如图2所示，溶剂量太少，原料不能溶解充分。增大溶剂量，粗多糖提取率增长迅速，当液料比超过30 mL·g-1，粗多糖提取率缓慢增长。这是因为液料比的提高增加了液体相和固体相间可溶物的浓度差，有利于粗多糖的溶出。当液料比超过30 mL·g-1时，也可能是黑木耳中的蛋白质和胶体发生饱和膨胀，容易形成对多糖的包裹，从而造成粗多糖得率增长缓慢。故进行Box-Behnken试验设计的液料比选择为30 ～ 50 mL·g-1。

2.1.3 超声时间对粗多糖提取的影响

超声时间对黑木耳中多糖提取率的影响如图3所示。

如图3所示，随超声时间的延长，黑木耳粗多糖提取率增大，当超声提取时间为25 min时提取率最高，此后延长时间，提取率反而有下降趋势，这是因为在超声波提取过程中，乙醇溶剂的挥发造成浸提不充分，超声波由于空穴作用，能够使液体局部发生高温高压，时间过长时，热量产生过多，糖类化合物易发生分解，提取率降低，故进行Box - Behnken试验设计的超声时间选择为20 ～ 30 min。

2.1.4 超声水浴温度对粗多糖提取的影响

超声水浴温度对黑木耳中多糖提取率的影响如图4所示。

如图4所示粗多糖得率随超声水浴温度升高出现最大值，超声水浴温度为60 ℃，此后超声水浴温度提高，粗多糖得率下降，这是因为温度太高，粗多糖热稳定性下降，杂质溶出概率变大，造成粗多糖得率下降。故进行Box-Behnken试验设计的超声水浴温度选择为55～65 ℃。

2.2.1 响应面设计及结果

根据表1中黑木耳粗多糖响应面试验设计，通过Design-Expert.V8.0.6软件进行Box -Behnken试验设计，共进行29组试验。试验设计及结果见表2所示。

2.2.2 响应面的建立与分析 以多糖提取率（Y）为响应值，对表2中数据进行分析，通过回归拟合各响应因素，得二次多项回归方程为：Y = （14.31 + 0.65A + 0.053B - 0.11C - 0.63D - 0.43AB + 0.54AC + 0.10AD +

0.24BC - 1.02BD - 1.18CD - 1.08A2 - 1.23B2 - 1.31C2 - 1.22D2）。

从表3中可以看出该模型回归显著（F=117.86，PP=0.060 9，没有显著差异;确定系数R2=0.991 6，调整系数RAdj2=0.983 2，说明该模型能够较好的拟合实际实验，各响应因子与响应值的关系可以用上述回归方程进行描述，并预测黑木耳粗多糖提取率。回归模型中由一次项的P值（A：2、B2、C2、D2）均为模型极显著因素;交互项AB、AC、BC、BD、CD均为模型显著因素，AD为模型不显著因素，不能明显影响黑木耳中粗多糖的提取率。此外，从各项的F值（A：177.86，B：1.18，C：5.33，D：167.45）可以看出，各因素在所选的水平范围内，对粗多糖提取率的影响由大到小依次为：超声功率、超声水浴温度、超声时间、料液比。

2.2.3 响应面交互作用分析

评价试验因素对黑木耳多糖提取率的两两交互作用，对各因素的最佳水平范围进行确定，可以根据所建立的二次模型做出的响应曲面及其相应的等高线图[14-15]。将建立的回归模型中的任一因素固定在零水平（降维处理），得到另外两个因素的交互作用结果如图5所示。

各因素对黑木耳中多糖提取率的影响程度可以由响应曲面的陡峭程度反映，响应曲面越陡，该因素对多糖提取率的影响越大，响应值对于操作条件的改变越敏感。交互效应的强弱可以由等高线的形状反映，两因素交互作用不显著则表现为圆形，反之，则为椭圆形。由图5-A响应面图可知，超声水浴温度的曲面斜率略大于超声时间的;由图5-a等高线图可知，等高线沿超声水浴温度轴向变化密集，说明响应值受超声水浴温度的影响比受超声时间的影响显著，由此可知，超声水浴温度和超声时间的交互作用极显著，前者对黑木耳多糖提取率的影響大于后者，即多糖提取率对超声水浴温度的变化比对超声时间的变化敏感。

同理，结合表3的交互相P值、F值，分析响应面图与等高线图5-A、a，5-B、b，5-C、c，5-D、d，5-E、e，5-F、f可以看出，超声水浴温度和料液比的交互作用极显著，前者的曲面斜率略大于后者，等高线沿超声水浴温度轴向变化密集，说明响应值受超声水浴温度的影响比受料液比的影响显著;超声功率和超声时间的交互作用极显著，前者的曲面斜率略大于后者，说明响应值受前者影响比后者的影响显著;超声功率和料液比的交互作用极显著，前者的曲面斜率略大于后者，等高线沿超声功率轴向变化密集，说明响应值受超声功率的影响比料液比的影响显著;超声时间和料液比的交互作用显著，前者的曲面斜率略大于后者，等高线沿超声时间轴向变化密集，说明响应值受超声时间的影响比料液比的影响显著;而超声功率与超声水浴温度的交互性最差，P值远大于0.05且等高线图基本呈圆形，整体梯度变化不明显，所以超声频率和超声水浴温度的交互性可忽略，即两者中任一因素对多糖提取率的影响规律不会随着另一因素的变化出现明显变化。