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表达序列标签(est)在基因组学研究中的应用序列标签（Sequence Tag）是指由DNA或RNA片段构成的一系列序列标记，它可以在遗传疾病、基因表达、信号转导等生命科学研究中发挥重要作用。
其中，表达序列标签（EST）是一种简单而有效的标记技术，它的应用在基因组学领域得到了广泛关注。
一、EST技术简介EST技术是一种由测序技术支持的高通量筛选技术，其主要原理是通过随机挑选某些不同的cDNA克隆来获得所需的不同的EST序列。
它的应用可以大大降低生物学研究的难度，也可以在较短的时间内获得大量的基因序列。
二、EST在基因组学研究中的应用（一）基因组注释及功能预测基因组注释是指对基因组序列进行生物信息学分析，以确定其中的基因区域和基因的结构。
EST技术可以通过对基因组序列的全长编码区域进行建库、测序和组装，从而确定基因的结构和位置，从而实现基因组注释。
（二）基因家族的发现和分类EST技术可以应用于表达的基因家族的发现和分类，例如受体基因、酶基因和转录因子基因家族等。
EST序列可以用作启动点，通过比对模式，可将同源序列聚类形成基因家族，并进一步研究其与环境、生长过程或其它生物学过程的关系。
（三）隐形基因的寻找传统的基因克隆方法主要寻找已知的基因进行克隆，而隐形基因（也称未知基因）的寻找则需要更为深入的研究。
EST技术可以通过测序与注释，从全基因组的角度分析，实现隐形基因的发现。
这可以为了解未知疾病的发病机制、发病率等方面提供重要支持和信息。
（四）基因调控机理的研究EST技术不仅可以应用于基因组学研究，还可以应用于表观遗传学——研究基因调控机理。
EST序列常常用于测定细胞特异性基因表达、基因表达的时间和空间分布等方面。
它对于异等基因的表达差异、组织特异性基因表达模式、静态和动态转录调控等具有重要的科研价值。
同时，它还可以用于筛选差异表达基因，并进一步研究其相关的信号传导机制、生长发育机制等。
三、结论在基因组学研究中，EST技术可以为高通量测序提供支持，并更好地揭示基因组结构和基因调控机制。
一、引言枇杷是一种常见的中药材和水果，其品种繁多，形态特征变异较大。
鉴别枇杷品种对种植、销售及科研具有重要意义。
传统的鉴定方法主要依靠形态学特征和生物学特性，但存在主管专家有限、耗时、费力、受环境和经验等因素影响的缺点。
近年来，基于现代分子生物学方法的est-ssr标记技术已经被广泛应用于枇杷品种的鉴定，具有高效、快速、准确的优势。
二、est-ssr标记技术的原理est-ssr（expressed sequence tag-derived simple sequence repeat）标记是利用EST数据（表达序列标签）进行简单重复序列的分析，并进行标记。
est-ssr标记是一种分子标记技术，利用基因组中的微卫星序列进行检测，并通过PCR扩增技术进行鉴定。
由于EST数据是从不同组织、不同生长阶段的cDNA样本中获得的，因此est-ssr 标记具有较强的系统进化、物种特异性和表达特异性。
三、est-ssr标记技术在枇杷品种鉴定中的应用1. 枇杷品种鉴定样本的准备在进行枇杷品种鉴定之前，首先需要收集不同品种的叶片或幼芽作为样本。
为了保证est-ssr标记技术的高效性和准确性，样本的选择和处理非常重要。
样本应选择来自不同地区或不同时间的品种，避免同一地区、同一种植基地或同一批次的样本。
样本的保存和处理过程中需要注意避免DNA的污染和降解。
2. est-ssr标记技术的实验步骤est-ssr标记技术主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。
首先需要从样本中提取DNA，可以采用CTAB法或商用DNA提取试剂盒进行提取。
提取的DNA需要经过质量检测，确保其完整性和纯度。
接下来是PCR扩增反应，选择合适的est-ssr引物进行扩增，PCR扩增条件需要进行优化，以获得清晰、特异的条带。
最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，根据PCR扩增产物大小和样品条带图谱的差异，进行品种鉴定和分析。
3. est-ssr标记技术的数据分析和结果解读通过PCR扩增和电泳分析得到样品的est-ssr标记图谱，根据条带长度和数量对不同品种进行鉴别。
辣椒EST-SSR标记的开发与应用的开题报告一、研究背景随着生态环境的恶化和气候变化的加剧，粮食生产的保障已成为世界各国面临的主要问题之一。
作为全球最大的农业生产国之一，中国在农业科技领域的研究一直处于全球领先水平。
然而，中国的农业生产中也存在一些问题，如农作物病虫害的防治难度加大、民间品种资源损失严重等。
而众所周知的是，中国的辣椒产业领先于全球，而辣椒病虫害也是该行业经常面临的挑战，因此，如何提高辣椒的耐病性、抗虫性、抗旱性等方面的农艺性状，成为提高辣椒品质、产量和农业可持续发展的重要途径。
基因编辑技术由于其可针对性强、效率高等优点，成为植物品种改良的研究热点之一。
带有正负选择标记的基因编辑技术可以直接实现目标基因的精确编辑，但同时还需设计适当的筛选方法来选择目标编辑体细胞中的突变基因。
基因标记技术可以通过标记特定的基因位点，从而实现对基因编辑体细胞的选育，提高编辑概率和筛选效率。
目前已有许多植物中的EST-SSR标记被开发出来，并应用于育种、基因图谱构建等方面。
因此，本研究拟对辣椒品种进行EST-SSR标记的开发，以实现辣椒优良品种的精确选育和育种技术的提高。
二、研究目的和内容本研究旨在开发辣椒EST-SSR标记，并应用该标记于辣椒品种的育种工作中，以实现辣椒的高效精准选育。
具体研究内容包括：1、建立辣椒品种的EST数据库和SSR标记库。
2、筛选和确定基因编辑所需的EST-SSR标记。
3、利用EST-SSR标记对辣椒品种进行育种。
4、评估育种效果和提高育种策略。
三、研究方法和流程1、实验材料本研究选取常用的辣椒品种作为实验材料，同时，选取适合EST-SSR标记开发的干旱逆境条件作为筛选条件。
2、建立EST数据库和SSR标记库采用转录组测序技术，对辣椒花、果皮等组织进行转录组测序，获得以Illumina HiSeq 2000平台生成的EST序列数据，并利用BLAST （version 2.2）软件将获得的序列比对到公共数据库中，从而建立辣椒品种的EST数据库。
文章编号:1000-1573(2002)01-0090-05SSR 和ISSR 分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用张立荣,徐大庆,刘大群(河北农业大学植保学院,河北保定071001)摘要:SSR(Si mple Seq uence Repeat)和ISSR (Inter-Si mple Seq uence Repeat)技术是在PCR 基础上发展起来的两种DNA 多态性检测技术,已开始应用于基因组研究的各个领域。
概述了SSR 、ISSR 反应的原理、特点,总结了其在植物亲缘关系和遗传多态性研究、DNA 指纹库的建立、遗传图谱的构建和基因定位及分子标记辅助育种等方面的应用,并肯定了SSR 、ISSR 在植物遗传育种领域的广阔应用前景。
关键词:SSR;ISSR;分子标记;遗传育种中图分类号:S 435 文献标识码:ASSR marker,ISSR marker and their applicationto plant genetics and breedingZHAN G L -i rong,XU Da -qing,LIU Da -qun(College of Plant Protection,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)Abstract:Simple sequence repeats (SSR)and Inter-simple sequence repeats (ISSR)are two kinds of DNA markers based on the polymerase chain reaction (PCR).They have been applied in many aspects of genome re -search.This paper has clarified the theories and characteristics of SSR as well as ISSR.The authers also sum -marized their applications in genetic polymorphisim and genetic relationship,establishment of DNA fingerprinting pool,construction of genetic map,gene localization and marker-aided selection.The two methods of DNA ec -ular marker open up broad prospec ts for the studies of plant genetics and breeding.Key words:SSR;ISSR;molecular marker;genetics breeding近年来,分子标记的研究与利用得到了迅速的发展。
ＳＳＲ标记在棉花遗传育种中的应用摘要SSR是建立在PCR基础上的分子标记，具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点，已在棉花研究中被广泛应用。
综述了SSR标记的原理与特点，以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及QTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用；展望了SSR分子标记技术广阔的应用前景。
关键词SSR；棉花；遗传育种SSR（Simple Sequence Repeats）标记即微卫星标记，是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成，长度一般在200bp以下，两端为较保守的单拷贝序列。
通过重复次数不同及重复程度不完全相同而呈现多态性，呈孟德尔式遗传，共显性。
SSR标记广泛存在于基因组的不同位置，根据两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，进行PCR扩增，经电泳、显色，便能测出不同个体在某个SSR位点上的多态性，在此基础上进行相应的分析。
棉花基因组中存在丰富的SSR标记，而且分布均匀，检测出的多态性频率较高，已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质鉴定、分子标记辅助选择等方面的研究。
1SSR的基本原理及特点微卫星DNA由两部分组成，即核心序列和两翼的序列，核心序列即前面所称“重复”的短序列，两侧一般是相对保守的单拷贝序列。
在PCR基础上的SSR 分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物，以总基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离，用放射自显影、银染或荧光进行检测。
这种序列广泛分布于真核生物基因组，其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。
由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物便可以PCR扩增，进行多态性检测。
与其他分子标记相比，SSR有以下优点：①共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律[1，2]；②多态性高，可通过PCR扩增呈现出来，试验程序简单，重复性高；③SSR序列的两侧序列较保守，在等位基因中多相同，便于重复利用已知引物；④易于检测、重复性好、可进行自动化分析，1个位点一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测；⑤对DNA质量和数量的要求不高，仅需微量组织便能有效的分析鉴定。
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第２期㊀１３７~１４０ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１５￣１１￣２７ꎻ接受日期:２０１６￣０１￣１２㊀基金项目:山西省农业科学院博士基金(ＹＢＳＪＪ１２０２)资助ꎮ㊀作者简介:ɦ董志刚与刘政海为本文共同第一作者ꎮ董志刚ꎬ副研究员ꎬ博士ꎬ研究方向为葡萄遗传育种及种质资源鉴定评价ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｇｓｓｄｚｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ刘政海ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为酿酒葡萄品种选育及种质资源鉴定评价ꎮＴｅｌ:０３５４￣６２１５０１５ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｇｓｓｄｚｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:唐晓萍ꎬ研究员ꎬ博士ꎬ研究方向为葡萄栽培育种ꎮＴｅｌ:０３５４￣６２１５０１５ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｔｘｐ￣１９５９０４０１＠１６３.ｃｏｍＳＳＲ标记技术在葡萄品种鉴别及遗传育种上的应用董志刚１ɦꎬ㊀刘政海２ɦꎬ㊀李晓梅１ꎬ㊀谭㊀伟１ꎬ㊀王新平１ꎬ㊀茹慧玲１ꎬ㊀唐晓萍１∗１.山西省农业科学院果树研究所ꎬ山西太谷０３０８１５ꎻ２.山西农业大学ꎬ山西太谷０３０８０１摘㊀要:ＳＳＲ标记因其数量多㊁重复性好㊁出现频率高和共显性遗传等优点在植物的种质资源品种鉴别㊁遗传育种等方面得到广泛应用ꎮ简要介绍了ＳＳＲ标记在葡萄上的发展和葡萄遗传多样性分析㊁品种鉴定㊁ＤＮＡ指纹图谱构建和遗传育种等方面的应用ꎬ并对ＳＳＲ标记未来在葡萄育种应用的研究方向作出了展望ꎮ关键词:葡萄ꎻＳＳＲ标记ꎻ遗传育种ꎻ遗传多样性ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０２.１０ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＳＲＭａｒｋｅｒｓｉｎＶａｒｉｅｔｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＤＯＮＧＺｈｉ￣ｇａｎｇ１ɦꎬＬＩＵＺｈｅｎｇ￣ｈａｉ２ɦꎬＬＩＸｉａｏ￣ｍｅｉ１ꎬＴＡＮＷｅｉ１ꎬＷＡＮＧＸｉｎ￣ｐｉｎｇ１ꎬＲＵＨｕｉ￣ｌｉｎｇ１ꎬＴＡＮＧＸｉａｏ￣ｐｉｎｇ１∗１.ＰｏｍｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｘｉＴａｉｇｕ０３０８１５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｘｉＴａｉｇｕ０３０８０１ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＳＳＲ(ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ)ｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｂｅｃａｕｓｅｉｔｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆａｂｕｎｄａｎｔｑｕａｎｔｉｔｙꎬｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙꎬｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃꎬｃｏｄｏｍｉｎａｎｔｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅａｎｄｓｏｏｎ.ＴｈｅｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｉｎｇｒａｐｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬｖａｒｉｅｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｂｒｅｅｄｉｎｇ.ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｉｎｇｒａｐｅｂｒｅｅｄｉｎｇｗａｓａｌｓｏｐｒｅｓｅｎｔｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａꎻＳＳＲｍａｒｋｅｒｓꎻｇｅｎｅｔｉｃｂｒｅｅｄｉｎｇꎻｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ㊀㊀葡萄(Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ)为葡萄科(Ｖｉｔａｃｅａｅ)葡萄属(Ｖｉｔｉｓ)的多年生藤本植物ꎬ在全世界范围内广泛栽培ꎬ其种植历史久远ꎬ可以追溯到约８０００多年前[１]ꎮ葡萄在其进化发展过程中形成了许多种群㊁品种群和变种群ꎬ且因其基因组杂合度高ꎬ不同种间以及品种间经济性状㊁抗逆性状等方面存在着极其丰富的变异ꎬ导致种质资源鉴定分类和抗性基因利用十分困难[２]ꎮ随着生物技术的迅速发展ꎬ区别于以形态学标记为主的葡萄种质资源分类ꎬ从分子水平对物种的亲缘关系进行分析更加直接准确ꎮＳＳＲ标记是一种基于ＰＣＲ技术的ＤＮＡ标记方法ꎬ具有数量多㊁重复性好㊁出现频率高和共显性遗传等优点ꎬ目前ꎬ在ＥＳＴ数据库的利用㊁系谱重建㊁品种鉴别及新品种保护等领域展示出巨大的发展潜力ꎮ在葡萄遗传多样性分析㊁品种鉴定㊁遗传指纹图谱构建和葡萄育种等方面得到了较广泛的应用ꎮ本文综述了ＳＳＲ分子标记在葡萄品种鉴别及遗传育种方面的研究进展ꎬ并对ＳＳＲ在未来葡萄育种方面的应用进行了展望ꎬ以期为葡萄的品种鉴别和遗传育种研究提供参考ꎮ. All Rights Reserved.１㊀不同ＳＳＲ标记技术在葡萄中的应用１.１㊀ＥＳＴ￣ＳＳＲ分子标记在葡萄中的应用近几年随着国内外对功能基因研究的不断深入ꎬ产生了许多ＥＳＴ数据库ꎬ其中包含大量的ＳＳＲ分子标记ꎬＥＳＴ￣ＳＳＲ分子标记技术随之产生ꎬ因其保守程度更高ꎬ转移率也较大ꎬ不同物种的通用性强ꎬ且经济便捷ꎬ迅速得到应用ꎮ王娟等[３]通过构建聚类树状图分析葡萄不同品种间的亲缘关系ꎬ验证了ＥＳＴ￣ＳＳＲ技术在对葡萄种质分类鉴定中的可行性ꎮ通过筛选１６对ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物对６２份葡萄材料进行分子水平的比较分析ꎬ发现６２份材料相似系数在０.４８~１.００之间ꎬ为葡萄亲缘关系探讨提供了可靠的分子生物学依据ꎮ１.２㊀ｃｐＳＳＲ分子标记在葡萄上的应用叶绿体微卫星(ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＳＳＲꎬｃｐＳＳＲ)是近几年发展起来的一种基于叶绿体基因组的分子标记技术ꎮ叶绿体基因组相比核基因组具有以下特点:分子量小㊁结构简单㊁其中多为环状双链ＤＮＡꎻ为原核性ꎬ序列保守ꎬ进化速率慢ꎻ具有单亲遗传特性ꎬ不参与基因重组ꎬ为独立遗传进化ꎮ这些特性决定了ｃｐＳＳＲ对植物进行系统性和进化学研究具有很大的优势ꎮ易官美等[４]利用ｃｐＳＳＲ分子标记对榧树１０个自然分布群进行了遗传多样性分析ꎬ解释了榧树经历历史遗传漂变形成单倍型分布式样的重要原因ꎮ陈平等[５]利用ｃｐＳＳＲ引物对苎麻属进行亲缘分析ꎬ在２２对引物中筛选出５对引物ꎬ共扩增出１６条多态带ꎬ聚类分析分为３类ꎬ结果与传统方式一致ꎬ而且其多态比例为２２.７３％ꎬ表明ｃｐＳＳＲ具有较好的通用性ꎮ开发适宜的ｃｐＳＳＲ引物ꎬ在葡萄起源研究和亲缘关系鉴定方面必将得到极大的应用ꎮ１.３㊀ＩＳＳＲ分子标记在葡萄上的应用ＩＳＳＲ(ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ)标记技术也是在ＳＳＲ基础上发展起来的一项新型标记技术ꎬ由于其引物设计比ＳＳＲ简单ꎬ不需像ＳＳＲ引物那样通过测序获得ＳＳＲ两侧的单拷贝序列ꎬ开发费用较低ꎬ同时ꎬ与ＳＳＲ标记相比ꎬＩＳＳＲ引物可以在不同的物种间通用ꎬ多态性高㊁重复性好ꎬ能够提供更多的基因组信息ꎮ目前ꎬＩＳＳＲ标记已广泛应用于植物品种鉴定㊁遗传作图㊁基因定位㊁遗传多样性㊁进化及分子生态学研究中ꎮ李继洋等[６]对１９个新疆葡萄品种进行了分析ꎬ利用２条ＩＳＳＲ引物构建了１４个葡萄品种的ＤＮＡ指纹图谱ꎬ提供了利用ＩＳＳＲ分析葡萄品种亲缘关系和遗传多样性的新方法ꎬ建立的葡萄指纹图谱为今后探索葡萄种质资源奠定了基础ꎮ２㊀ＳＳＲ标记在不同葡萄研究领域中的应用２.１㊀ＳＳＲ标记在葡萄遗传多样性中的应用遗传多样性是指同一物种种内的性状差异ꎬ能够反映一个物种适应环境的能力和所具有的被改造㊁利用的潜力大小ꎬ是育种工作的基础[７]ꎮ葡萄品种繁多ꎬ包括大量天然杂交品种和实生选育品种ꎬＳＳＲ标记的高多态性对于如此繁多复杂的品种进行判定提供了有效手段ꎮ郝宇等[８]㊁方连玉等[９]分别对供试葡萄种质资源进行了遗传多样性分析ꎮＢａｎｅｈ等[１０]利用１３条葡萄染色体上的２３个ＳＳＲ标记位点ꎬ研究了伊朗葡萄的遗传演化及其遗传多样性ꎬ发现了一批有价值的葡萄种质资源ꎮ郭春苗等[１１]利用ＳＳＲ分子标记技术进行了葡萄品种(系)遗传多样性分析与指纹图谱构建ꎬ并对新疆４４个相对适宜制干葡萄品种(系)进行了遗传多样性研究ꎮ２.２㊀ＳＳＲ标记在葡萄品种鉴定中的应用葡萄是一个历史悠久的物种ꎬ目前已知有８０００个以上的品种ꎬ分布在世界广大地区ꎬ并且葡萄品种极易发生芽变变异ꎬ这使得葡萄同物异名及同名异物的现象较多ꎬ因此在葡萄研究和生产实践中ꎬ品种鉴别成为重要环节之一ꎮ之前的研究主要利用葡萄的形态学㊁生理学㊁农艺性状特征进行鉴定和分类ꎬ但由于基因和环境的互作影响ꎬ这些鉴定方法具有很大局限性ꎮ利用ＳＳＲ标记可对葡萄品种进行快捷准确的鉴定ꎬ同时可对其亲缘关系进行分析ꎮＢｏｗｅｒｓ等[１２]应用ＳＳＲ技术成功鉴定了酿酒葡萄品种赤霞珠的亲本是品丽珠和索维浓ꎮ吴子龙等[１３]利用９对多态性较高的ＳＳＲ引物区别了８个山葡萄及山欧杂种葡萄品种ꎮ８３１生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.２.３㊀ＳＳＲ标记在构建葡萄ＤＮＡ指纹图谱中的应用随着人们对品种保护意识的增强ꎬ许多植物开始构建ＤＮＡ指纹图谱ꎮ利用ＳＳＲ分子标记技术构建葡萄的ＤＮＡ指纹图谱ꎬ可为保护葡萄品种的自主知识产权㊁鉴定和检测葡萄品种苗木真实性和纯度提供客观㊁科学和准确的技术保障ꎮ杜晶晶等[１４]利用ＳＳＲ标记技术为中国农业科学院国家葡萄资源圃８０份葡萄材料构建了分子身份证编码ꎮ通过筛选后的ＳＳＲ引物对葡萄种质进行了区分ꎬ平均一对引物区分种质８.９份ꎬ实验结果更加准确ꎬ实验方法更加简便ꎬ使得利用ＳＳＲ标记构建葡萄种质分子身份证成为可能ꎮＷａｒｒｅｎ等[１５]对２１个葡萄品种和４个杂交种后代的１１０份资源进行ＳＳＲ指纹图谱分析ꎬ结果发现ꎬ已有研究划分的归属于２个不同种的葡萄资源拥有完全相同的ＳＳＲ指纹图谱ꎬ表明它们拥有相同的基因型ꎬ可能是同物异名ꎮ李雪雁等[１６]采用ＳＳＲ标记建立了７５份葡萄品种ＤＮＡ指纹图谱体系ꎻ李继洋等[６]利用２条ＩＳＳＲ引物构建了１４个品种的ＤＮＡ指纹图谱ꎬ图谱的建立为葡萄品种鉴定和亲缘分析提供了理论依据ꎮ尹玲等[１７]为我国近几年新育成的葡萄品种建立了指纹图谱ꎬ更清晰的追溯了他们的亲缘关系ꎬ完善了我国葡萄品种数据库ꎮ其研究表明ꎬ昌黎７号㊁昌黎８号㊁蜜光㊁春光㊁宝光和昌黎２１号等６个４倍体品种亲本均为巨峰ˑ早黑宝的后代ꎮＴｒｏｇｇｉｏ等[１８]以ＳＮＰ技术为基础建立了欧洲葡萄的遗传图谱ꎬ此图谱的构建使用了４８３个ＳＮＰ标记㊁１３２个ＳＳＲｓ标记和３７９个ＡＦＬＰ标记ꎬ为ＳＳＲ标记技术在亲缘关系更近的品种㊁品系的鉴别提供了依据ꎮ通过分子标记绘制的指纹图谱具有个体特异性ꎬ能准确㊁快速鉴定品种或品系ꎬ该技术为作物育种和种质管理提供了极大的便利ꎬ有利于推动我国果树苗木向着规范化㊁制度化和法制化的方向快速发展ꎮ２.４㊀ＳＳＲ标记在葡萄育种中的应用赖呈纯等[１９]利用ＩＳＳＲ分子标记技术对９５份葡萄品种(系)资源进行了遗传多样性和亲缘关系分析ꎬ结果表明ꎬ１２条引物扩增出１６０个清晰可辨的位点ꎬ品种间的遗传相似系数为０.５５~０.９９ꎬ聚类分析结果表明ꎬ９５份葡萄资源划分为３大类:欧亚种㊁欧美杂种和东亚种群ꎮＬｉ等[２０]通过利用与无核相关的分子标记进行早期目标性状的筛选ꎬ解释了葡萄种子败育的机制ꎮ陶红霞等[２１]利用ＳＳＲ标记对黑心病基因定位ꎬ寻找与抗性目标性状紧密连锁的分子标记ꎬ探讨了黑心病的遗传基础ꎬ为培育抗黑心病品种提供了重要方法ꎮＳＳＲ分子标记为发现丰富的遗传品种和种质资源提供了有效的手段ꎬ在杂交前通过ＳＳＲ分子标记对预选亲本的亲缘关系进行分析ꎬ为育种亲本的选配提供了更为明确的方向性和目标性ꎬ为优良基因的有效利用和进行分子标记辅助选择育种提供了理论支持ꎮ３㊀展望随着ＤＮＡ分子标记技术在各方面的应用ꎬＳＳＲ标记的开发更加快速ꎮＳＳＲ分子标记将和其他类型的标记一起在葡萄遗传多样性㊁品种鉴定㊁遗传图谱和育种等方面得到更加广泛的应用ꎬ在进行芽变品种的鉴别㊁嫁接苗砧木品种的鉴定㊁葡萄加工品种的筛选方面展现更大的潜力[２１ꎬ２２]ꎮ我国野生葡萄资源丰富ꎬ而且变异类型多样ꎬ而这些野生品种往往具有较高的抗寒性㊁抗病性等特性[２３]ꎬＳＳＲ分子标记可以为利用和保护好这些宝贵的种质资源的相关研究提供更多帮助ꎮ科研工作者已将ＳＳＲ分子标记技术应用到葡萄抗病性研究中ꎬ并取得了一定进展ꎮ这些研究将有利于对杂种进行早期抗性选择ꎬ缩短育种周期ꎬ大大提高育种效率ꎮ在今后葡萄遗传育种的研究中ꎬＳＳＲ分子标记将有越来越大的发展空间ꎬ我们可以通过ＳＳＲ分子标记构建葡萄属植物的系统发育树ꎬ建立我国葡萄资源指纹图谱数据库ꎬ充分利用我国丰富的葡萄资源ꎬ通过种间杂交㊁芽变体筛选ꎬ定位我国葡萄资源的抗性和品质基因ꎬ以及预测杂交优势ꎬ使育种更具方向性和目的性ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦｉｓｃｈｅｒＢＭꎬＳａｌａｋｈｕｔｄｉｎｏｖＩꎬＡｋｋｕｒｔＭꎬｅｔａｌ..Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｕｎｇａｌｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｎａｍｏ￣ｌｅｃｕｌａｒｍａｐｏｆｇｒａｐｅｖｉｎｅ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒ.Ａｐｐｌ.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ２００４ꎬ１０８(３):５０１－５１５.[２]㊀ＺｈａｎｇＷＷꎬＰａｎＪＳꎬＨｅＨＬꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｆｏｒｃｕｃｕｍｂｅｒ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒ.Ａｐｐｌ.９３１董志刚ꎬ等:ＳＳＲ标记技术在葡萄品种鉴别及遗传育种上的应用. All Rights Reserved.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ２０１２ꎬ１２４(２):２４９－２５９.[３]㊀王娟ꎬ陶永焕ꎬ宋尚伟.葡萄ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物的开发及部分种质聚类分析[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１４ꎬ２９(２):１２１－１２６. [４]㊀易官美ꎬ邱迎君.榧树居群遗传多样性的ｃｐＳＳＲ分析[Ｊ].果树学报ꎬ２０１４ꎬ３１(４):５８３－５８８.[５]㊀陈平ꎬ喻春明ꎬ王延周ꎬ等.苎麻ｃｐＳＳＲ标记筛选及在亲缘关系研究中的应用[Ｊ].湖北农业科学ꎬ２０１４ꎬ２１(５３):５０８４－５０８６.[６]㊀李继洋ꎬ代培红ꎬ罗淑萍.基于ＩＳＳＲ的葡萄品种亲缘关系分析及其指纹图谱构建[Ｊ].新疆农业大学学报ꎬ２０１４ꎬ３７(１):２４－２９.[７]㊀张金然.ＤＮＡ分子标记在林木遗传育种中的应用[Ｊ].林业科学ꎬ２０１４ꎬ１１:９９－１０１[８]㊀郝宇ꎬ张淑静ꎬ张世红ꎬ等.葡萄品种资源的ＳＳＲ鉴定及遗传多样性分析[Ｊ].河北农业大学学报ꎬ２０１１ꎬ３３(１):５４－５９.[９]㊀方连玉ꎬ王军ꎬ许雷ꎬ等.１５份葡萄种质遗传多样性的ＳＳＲ分析[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０１０ꎬ８(３):５１１－５１５.[１０]㊀Ｄｏｕｌａｔｉ￣ｂａｎｅｈＨꎬＭｏｈａｍｍａｄｉＳＡꎬＬａｂｒａＭ.ＧｅｎｅｔｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ.ｃｕｌｔｉｖａｒｓｆｒｏｍＩｒａｎｕｓｉｎｇＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ[Ｊ].Ｓｃｉ.Ｈｏｒｔｉｃｕｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６０:２９－３６. [１１]㊀ＢｏｗｅｒｓＪＥꎬＭｅｒｅｄｉｔｈＣＰ.Ｔｈｅｐａｒｅｎｔａｇｅｏｆａｃｌａｓｓｉｃｗｉｎｅｇｒａｐｅｃａｂｅｒｎｅｔｓａｕｖｉｇｎｏｎ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ１９９７ꎬ１６(１):８４－８７.[１２]㊀郭春苗ꎬ李宁ꎬ周晓明ꎬ等.基于ＳＳＲ标记的葡萄品种(系)遗传多样性分析与指纹图谱构建[Ｊ].新疆农业科学ꎬ２０１５ꎬ５２(１１):２０５１－２０５８.[１３]㊀吴子龙ꎬ王军ꎬ沈育杰ꎬ等.８个山葡萄及山欧杂种葡萄品种的ＳＳＲ分析[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２００８ꎬ９(１):１０５－１０９.[１４]㊀杜晶晶ꎬ刘国银ꎬ魏军亚ꎬ等.基于ＳＳＲ标记构建葡萄种质资源分子身份证[Ｊ].植物研究ꎬ２０１３ꎬ３３(２):２３２－２３７. 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第20卷 第4期2005年10月北 京 农 学 院 学 报J OU RNAL OF B EI J IN G A GRICUL TU RAL COLL EGEVol.20,No.4Oct.,2005 收稿日期:2005207223;修订日期:2005209222 基金项目:北京市自然科学基金(项目编号:5052006) 作者简介:谢皓,男,1962年出生,博士,副教授,研究方向为大豆遗传育种EST 2SSR 标记的发展和在植物遗传研究中的应用谢 皓1,陈学珍1,杨 柳2,王建立2(1.北京农学院植物科学技术系、2.农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206)摘要:SSR 标记已经成为植物遗传育种中应用的主要的分子标记之一,然而,SSR 引物的开发源于基因组文库,即花费大又效率低。
随着大量表达序列标签(ESTs )的出现,对于许多植物而言,利用ESTs 数据库开发SSR 引物是一项高效、低花费的选择。
目前,EST 2SSR 标记在一些植物中的利用已有报道,笔者就EST 2SSR 标记的发展和在植物遗传中应用的研究进展进行回顾和评述。
关 键 词:EST 2SSR 标记;应用;植物中图分类号:S75 文献标识码:A 文章编号:100223186(2005)0420073204Development and Application of EST 2SSR Marker in Plant G eneticXIE Hao ,C H EN Xue 2zhen ,YAN G Liu ,WAN G Jian 2li(Beijing Agricultural College ,Beijing 102206,China )Abstract :Simple sequence repeat s (SSRs )have become one of t he most usef ul molecular marker systems in plant genetic and breeding.The develop ment of SSR markers was Came genomic libraries ,it is expensive and inefficient.Wit h t he availability of large numbers of expressed sequence tags (ESTs ),develop ment of SSR markers t hrough data mining has become an efficient and low co st option for many plant species.Ap 2plication of SSR markers from ESTs (EST 2SSR )has been reported for a number of plant species.This pa 2per reviewed t he develop ment and applicatio n of EST 2SSR marker in plant genetic.K ey w ords :EST 2SSR marker ;applicatio n ;plant SSR (simple sequence repeat 简单重复序列),又称微卫星(micro satellite )或STR (short tandem repeat 短串联重复),广泛分布于人类和其他动植物基因组中,以小麦为例,基因组中平均每292kb 和212kb 就分别含有一个二核苷酸重复(AC )n 和(A G )n ,三核苷酸重复(TC T )n 和(T T G )n 大约是二核苷酸重复序列的10%[1]。
SSR 分子标记具有以下特点:(1)在植物的基因组中分布广泛、随机、均匀;(2)SSR 序列的两侧顺序比较保守;(3)多数SSR 无功能作用,增加或减少几个重复序列的频率较高,在品种间具有广泛的位点变异;(4)SSR 标记表现共显性的孟德尔式遗传方式;(5)扩增时模板DNA 需要量少,即便DNA 降解,也能有效地分析鉴定。
基于上述特点,SSR 已成为在生物上应用最广、最为重要的分子标记。
在植物遗传育种中,SSR 标记已经在植物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、品种鉴定、外源染色体片段或目的基因鉴定和定位、分子标记辅助选择育种等方面得到应用。
传统的SSR 标记引物设计过程较慢,需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等环节。
SSR 引物的获得,花费的时间长,费用较大,效率低。
EST s (expressed sequence tags ,EST s ,中文直译为表达序列标签)的出现为SSR 的发展提供了新的来源。
EST s 是一段短的cDNA 序列,大约200～700bp ,随着大规模植物基因的测序工作而产生,作为某一基因的特有序列,早期用来在DNA 和蛋白质数据库中搜索查询相似的基因。
ESTs 近年来发展十分迅速,2000年5月在Gen 2Bank 中仅能发现9条小麦的ESTs ,86条大麦的ESTs ,而黑麦的没有一条。
现在,在GenBank 上能够检索的小麦、玉米、水稻和大豆就分别有数十万条之多,并且数目正不断增加。
ESTs 为SSR 标记的74 北 京 农 学 院 学 报第20卷创制提供一个巨大的、有价值的来源,能够克服SSR引物在创造时费用高的问题。
这种标记为了与传统的SSR标记相区别,一般称之为EST2SSR 标记(EST Micro satellite Marker)。
作为一种新的SSR标记的来源,EST2SSR标记已经在众多植物种类中得到证实和应用,例如,葡萄[2]、甘蔗[3]、小麦[4]、黑麦[5]、大麦[6]、大豆[7]、水稻[8]、高粱[8]、松树[9]及牧草[10]等物种。
笔者就EST2SSR标记发展和在植物遗传育种中应用的研究进展进行回顾,同时对EST2SSR标记发展趋势进行探讨。
1 利用ES Ts创造ES T2SSR引物 并非全部的ESTs都可用来设计SSR引物,这需要从ESTs中发现合适的简单重复序列。
首先利用SSRs鉴定软件对所需要种类的ESTs数据库进行ESTs可利用性筛选,例如,Simple Sequence Re2 peat Identification Tool,SSRIT,可在Cornell Uni2 versity网址/gramene/ searches/ssrtool下载。
利用该软件能够得到如下信息:ESTs的名称,重复碱基,重复次数,重复碱基开始和结束在ESTs中的位置以及该基因的功能。
然后,利用引物设计软件,例如Primer3(http:// /genome_software/ot h2 er/primer3.ht ml)。
在选出的ESTs中设计SSR引物。
设计引物的主要参数如下:引物长度为18～24个碱基,其中22个碱基最为适宜;PCR产物的分子量大小为125～325bp;最适的退火温度为60°C, GC的含量为40%～70%,最适为50%[9]。
ESTs数据库提供了一个SSRs序列的来源,从中可以容易地开发出SSR引物。
不过,能够用于引物设计的ESTs的数目较低,不同物种的利用率有一定差异,据Song等[7]报道大豆中可利用的ESTs 少于1%,Hackauf and Wehling[11]估计黑麦ESTs 的利用率为2%。
Kantety等[8]发现玉米ESTs中含有的SSRs只占115%,水稻中占417%。
Nicot 等[12]发现在小麦中可利用的ESTs占715%。
与Kantety等相比,两者的统计基数有所不同,前者SSRs的最小长度为18碱基,而后者为12个碱基,所以后者对EST的利用率高于前者。
Nicot等[12]同时发现,鉴定过的EST只有74%能够设计成引物,引物的70%可以扩增出多态性产物,其中68%的扩增质量较好。
类似的结果还有白苜蓿,其EST2 SSRs占710%,有71%可设计成引物,67%可扩增出多态性[13]。
Elena等[14]对黑麦的8930ESTs进行了筛选,发现207条具有二、三和四核苷酸重复序列,占全部的213%,其中65对设计成的引物(3114%)具有较好的扩增质量。
EST2SSR标记与SSR标记一样,分析是建立在PCR基础上,分析程序包括PCR扩增、电泳、显色和数据处理等。
获得引物后,对研究材料进行PCR扩增,产物通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或聚丙烯酰胺变性凝胶电泳等进行分离,最后用银染法、溴化乙锭染色法、荧光染料标记法或同位素放射性自显影法等显色观察,记录并处理数据。
多使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色。
2 ES T2SSR标记与SSR标记的比较 一般EST s中的重复序列要短于基因组中的SSRs,例如Arshchenkova and G anal[15]报道在番茄的27000条EST s中仅有20条所含的SSRs超过10个重复单位。
大麦中,来自EST s的SSRs(713重复单位)也短于来自基因组的SSRs(2217个重复单位)[16]。
在甘蔗中的平均重复次数为611比1317[17]。
Song等[7]测定了大豆中的136800条EST序列,发现10次以上的二核苷酸重复序列只有75条, 8次以上的三核苷酸重复序列只有58条,因此,大豆中的含有最低重复序列的ESTs少于1%。
用这113条ESTs设计了EST2SSR引物,仅有24个引物(占18%)可扩增出多态性。
对照来源于基因组的SSR引物,有43%引物可在同样的供试材料中产生多态性。
Eujayl等[4]利用64个小麦品系对22个EST2 SSR和20个SSR引物进行了检测比较,发现EST2 SSR引物能够产生较高质量的标记,但多态性较少,只占25%,而SSR引物产生的多态性占53%。
Fiona Leigh等[18]利用66个小麦品种对20个EST2 SSR引物和12个SSR引物进行了评价,认为EST2 SSR标记与SSR标记相比可产生高质量的DNA 图谱,但产生的谱带较少。
利用EST2SSR标记和SSR标记分别分辨66个品种中65个品种,EST2 SSR标记需要17个标记,而SSR标记只需要12标记,对比多态性信息量值(PIC,polymorp hic infor2 mation content),EST2SSR标记要低于SSR标记。
Cherdsak等[9]报道EST2SSR标记与传统的SSR 标记相比,在火炬松物种中有较高的转移频率,而多态性较低,序列分析表明ESTs中重复序列插入/删除和代换的频率低于其他类型的SSRs,证明EST22005年第4期谢 皓等:EST2SSR标记的发展和在植物遗传研究中的应用75SSRs有较高的保守性。
