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免疫共沉淀原理及实验方法

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注册┆登录┆发表文章免疫共沉淀原理及实验方法2007-03-22 16:07:46大中小免疫共沉淀一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。

抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。

建议仔细检查抗体的说明书。

特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。

多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。

为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。

另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。

即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。

抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。

缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

欲速则不达，确定好比例很必要。

(待续)二准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液 (最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%TritonX-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。

注意不易溶于水)2.NP40 lysis 缓冲液1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%NP40 25ml (1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 450mltoal 500ml使用前加1mM的PMSF注意点：*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。

TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<SDS是离子性的强活性剂。

注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。

1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。

*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。

根据自己需要调节。

EDTA用NaOH滴定。

Protocol1 调制protein A sapharoseprotein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。

旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。

避免长期保存。

2．抗原的检出以下操作全在冰面或4度进行去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。

加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。

RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。

30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。

不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h加protein A sapharose50ul，再混匀1h5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。

往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。

重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。

3.注意点A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。

对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。

B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。

(完)评论()引用阅读(876)圈子打印有奖举报免疫共沉淀原理及实验方法[SPAN class=java id=text9766]免疫共沉淀[BR]一原理：[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。

抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。

建议仔细检查抗体的说明书。

特别是多抗的特异性是问题。

[BR][BR]其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。

多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。

为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。

另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。

即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

[BR][BR]再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

[BR][BR]每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。

抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。

缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

欲速则不达，确定好比例很必要。

(待续)[BR]二准备：[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinA sapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液 (最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%TritonX-100 25ml (1%)[BR]10% DOC 50ml (1%)[BR]10%SDS 5ml ( o.1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 395ml[BR]toal 500ml[BR]另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。

注意不易溶于水)[BR]2.NP40 lysis 缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%NP40 25ml (1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 450ml[BR]toal 500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点：[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。

[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。

[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。

TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC＆lt;SDS是离子性的强活性剂。

注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。

1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。

[BR]*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。

根据自己需要调节。

EDTA用NaOH滴定。

[BR]Protocol[BR][BR]1 调制protein A sapharose[BR][BR]protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时，把protein A sapharose 先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。

旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s[BR][BR]去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。

避免长期保存。

[BR][BR]2．抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。

加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。

RIPA的量：6cm 的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。

[BR][BR]30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。

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免疫共沉淀试验原理及方法

免疫共沉淀试验原理及方法

免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。

首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。

然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。

最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。

1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。

首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。

接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。

随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。

最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。

2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。

首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。

接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。

随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。

最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。

1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。

2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。

3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。

然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。

2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。

3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。

总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。

根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。

免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。

它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。

本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。

该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。

3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。

可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。

同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。

2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。

此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。

3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。

为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。

4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。

可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。

通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。

5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。

洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。

6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

免疫共沉淀实验原理

免疫共沉淀实验原理

免疫共沉淀实验原理免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于研究蛋白质间的相互作用。

其原理是利用特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。

这种实验方法常用于研究蛋白质的定位、亚细胞定位、蛋白质复合物的组成以及蛋白质间的相互作用等。

下面将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验的原理可以简单描述为以下几个步骤：1. 抗体结合：首先，选择特异性抗体，该抗体能够与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据实验需求来确定。

将抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物。

2. 免疫复合物的富集：将免疫复合物与磁珠或琼脂糖等固相载体结合，形成免疫磁珠或免疫琼脂糖。

这些固相载体具有良好的亲和力，能够高效地捕获免疫复合物。

3. 样品处理：将待测样品加入到含有免疫磁珠或免疫琼脂糖的溶液中，使样品中的目标蛋白质与免疫复合物结合。

同时，对样品进行适当的处理，如细胞裂解、蛋白质交联等，以保持样品的完整性并增加结合效率。

4. 免疫共沉淀：将含有样品和免疫复合物的溶液进行充分混合，并进行一定时间的孵育，使目标蛋白质与免疫磁珠或免疫琼脂糖结合。

通过外加磁场或离心的方式，将免疫磁珠沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。

5. 洗涤：对沉淀下来的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

洗涤的条件需要根据实验需求进行优化，通常包括洗涤缓冲液的浓度、洗涤次数和洗涤时间等。

6. 析出：将洗涤后的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行脱盐或去除洗涤缓冲液，最终得到含有富集的目标蛋白质及其相互作用蛋白质的沉淀物。

7. 分析：对沉淀物进行进一步的分析，如Western blotting、质谱分析、原位杂交等，以研究蛋白质的相互作用关系、定位及功能等。

总结起来，免疫共沉淀实验是一种通过特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用蛋白质的实验方法。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。