微生物 实验六

实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。

二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

具体个原理如下：1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。

3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。

酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。

若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。

①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。

本次不做该试验。

②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。

③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。

由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。

④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。

实验六微生物计数和大小的测定一、实验目的1、了解目测微尺和物测微尺的结构和使用；2、了解血球记数板的结构；3、掌握血球记数板的使用和计算方法。

二、实验仪器和材料显微镜，目测微尺，物测微尺、血球记数板擦镜纸，香柏油，二甲苯，载玻片，盖玻片。

酵母悬液（或其他种微生物的悬液）。

三、实验方法和步骤1、目测微尺和物测微尺目测微尺外形与目镜相似，在中央刻有10毫米长的、等分100格的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数而定。

使用前用物测微尺标定，使用时放在目镜内。

物测微尺是一厚玻片，中央有一圆形盖玻片，中央刻有1毫米长的标尺，等分为100格，每格为10微米，用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。

2、用目测微尺和物测微尺测量酵母菌的大小①目测微尺的标定将目测微尺装入目镜筒后，把物测微尺放在载物台上使刻度朝上，用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。

再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。

实验记录表格1目镜放大倍数____________。

②菌体大小的测量将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别求出菌体的长和宽，再按目测微尺一格的长度算出菌体的长度和宽度。

（1）目测微尺的标定：（2）在高倍镜下测量酵母菌大小：3、血球记数板血球记数板是一块比普通载玻片厚的特制玻璃制成。

玻片中央刻有四条纵向槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中间有一横槽，槽的上下各有9个大方格，中间的一个方格为计数室，它的长和宽各为1毫米，深度为0.1毫米，其体积为0.1立方毫米。

每个大格分成16个中格，每个中格分成25个小格，共400个小格。

计算方法如下：细胞数/毫升=1个小格内的细胞数×400×10×1000×稀释倍数。

实验记录表格24、微生物记数（1）稀释菌液：为了便于记数，将样品适当稀释，使每格约有5~10个细胞。

实验六微生物细胞大小的测定一、目的要求1.学会测微尺的使用和计算方法。

2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。

二、基本原理微生物细胞大小, 是微生物的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。

由于菌体很小, 只能在显微镜下测量。

用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。

一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格）,每格长度等于0．01mm（即106μm）。

是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片, 其中央刻有精确的刻度, 有等分50小格或100小格两种, 每5小格间有一长线相隔。

由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同, 目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同, 因此,目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小, 在使用前必须用镜台测微尺进行校正, 以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值, 然后才可用来测量微生物的大小。

三、器材枯草芽孢杆菌染色玻片标本, 目镜测微尺, 镜台测微尺, 显微镜, 擦镜纸, 香柏油等。

四、操作步骤1. 目镜测微尺的标定(1)放置目镜测微尺取出接目镜, 旋开接目镜透镜, 将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图Ⅳ-4, B）, 然后旋上接目透镜, 最后将此接目镜插入镜筒内（图Ⅳ-4, C）。

(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上, 使刻度面朝上。

(3)校正目镜测微尺先用低倍镜观察, 对准焦距, 当看清镜台测微尺后, 转动接目镜, 使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行, 移动推动器, 使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合, 然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图Ⅳ-6）。

根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数, 通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。

目镜测微尺每小格长度（μm）=同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握i 微生物（细菌）鉴定中主要生化反应的常规实验法二、实验原理（一）大分子物质（如淀粉、明胶）在常规条件下不被降解成小分子物质，但某些微生物细胞能分泌胞外酶，使大分子物质降解。

大分子物质在微生物分泌的胞外酶的作用下分解成小分子物质。

1. 淀粉水解实验根据淀粉遇碘变蓝的原理，向含有淀粉培养基中加入碘产生淀粉酶无色透明圈微生物细胞无淀粉酶蓝色2. 明胶水解实验产生明胶酶的，明胶培养基在4 度时成液体状微生物细胞无明胶酶时，在明胶培养基在4 度成固体状（二）糖发酵实验不同的细菌分解糖，醇的能力不同，有些细菌分解某些糖产酸并产气，有的分解糖仅产酸而不产气，因此，可根据其分解利用糖的差异作为鉴定菌种的依据之一。

在糖发酵实验中，用溴甲酚紫作为指示剂，PH6.8时为紫色，当PH< 5.2时变为黄色，若细菌分解糖产酸，则培养液由紫色变为黄色，有无气体产生，可以从德汗氏小管中观察。

（三）IMVC 实验IMVC 实验主要包括吲哚（indol test）试验、甲基红（methyl red test）试验、柠檬酸盐（citrate test）试验、伏-普（Voges-Prokauer test）试验，这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细菌学检查甲基红试验（M.R.试验）某些细菌在糖代谢过程中，分解培养基中的糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸，乙酸等，使培养基的PH 值降至4.5 以下。

酸的产生可由甲基红的变色来指示。

甲基红的变色范围是PH4.2-6.3，PH4.2 时为红色，PH6.3 时为黄色。

若细菌分解葡萄糖产酸量少时，则培养基PH 值在6.3以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。

伏普试验有些细菌可以分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧产生乙酰甲基甲醇。

在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，二乙酰可以与培养基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基产生红色化合物。

实验六微生物对含碳化合物的分解利用★不同细菌对不同含碳化合物分解利用能力、代谢途径、代谢产物不完全相同。

例如有的细菌发醇葡萄糖产生有机酸；而另一些细菌则发酵葡萄糖产生中性的乙酰甲基甲醇等等。

此外微生物对含碳化合物的分解利用的生化反应也是菌种鉴定的重要依据。

现分别介绍糖或醇发酵试验、M．R．（甲基红）试验、V．P．（乙酰甲基甲醇）试验、柠檬酸盐利用试验以及过氧化氢酶试验的简单原理。

★(一) 糖或醇发酵试验细菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油)的能力有很大的差异。

有些细菌发酵某种糖后产生各种有机酸(如乳酸、醋酸、甲酸、琥珀酸)及各种气体(如H2、CO2、CH4)。

有的细菌只产酸不产气。

酸的产生可利用指示剂来指示。

在配制培养基时可预先加入溴甲酚紫[pH5(黄)-pH 7(紫)]。

当细菌发酵糖产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。

气体的产生可由糖发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。

糖醇类发酵实验1、培养前的情况；培养后小管中出现的气体★(二)甲基红(M．R．)试验某些细菌在糖代谢过程中，吸收培养基中的糖，然后分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。

酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。

甲基红的变色范围pH 4．2(红色)-pH 6．3(黄色)。

细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色变为红色，此为M．R．的阳性反应。

★(三)乙酰甲基甲醇(V．P．)试验某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇、然后被还原成2，3—丁二醇。

乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化生成二乙酰，二乙酰可与培养基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。

此为V．P．试验的阳性反应。

★(四)柠檬酸盐利用试验不同细菌利用柠檬酸盐能力不同，有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，有的则不能。

某些细菌将柠檬酸分解为二氧化碳，培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠，使培养基碱性增加。

实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。

2、实验过程简述2.1 培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、α-甲基葡萄糖苷的YNB 培养基，放入一根杜氏管。

2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB 的固体、液体培养基。

2.1.3 乙醇发酵用种子培养基：YPD 培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。

2.1.5抗生素效价测定用培养基：LB 培养基2.1.6青霉素：用pH 6.0 磷酸缓冲液配制，浓度为100 mg/ml，0.22μm 孔径过滤灭菌。

2.2 微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200 μl 菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48 h。

3、每24 h 观察记录生长和产气情况。

4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。

2.3 微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200μl 菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30℃或37℃静置培养48 h。

3、各取20μl 菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，培养皿倒置，静置培养48 h。

4、每24 h 观察记录生长情况，48 h 测定液体培养物的OD 600。

5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。

2.4 酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD 种子培养基中，30℃，200rpm，培养18 h。

2、乙醇发酵：按照10%（v/v）的比例将培养好的种子液接入100 ml 发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30℃，静置培养，每24 h 手摇1 次，发酵3-4 d。

实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。

微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。

所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。

微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。

（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。

2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。

3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。

二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。

利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。

用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。

不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。

常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。

通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。