厦门大学实验动物中心

圆园21年3月第42卷第6期DOI ：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.06.009作者简介：孙美君（1996—），女（汉），硕士，研究方向：应用营养。

*通信作者：李蕾（1976—），女（汉），副教授，研究方向：营养资源的开发与应用。

橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究孙美君1，孔杭如2，赵珈莹1，张伊瑾1，林丽颖1，郭东北1，李蕾1*（1.厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，福建厦门361102；2.中粮营养健康研究院，北京102200）摘要：采用超声辅助水提法制备橄榄叶提取物（olive leaf extracts ，OLE ），测定其多酚含量，并研究OLE 对辐射小鼠的防护作用。

给予小鼠不同剂量OLE （150、500、1000mg/kg ）后，1Gy X 射线全身辐照小鼠，测定辐射小鼠外周血细胞数量、血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）与谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase ，GSH-Px ）活力、丙二醛（malondialdehyde ，MDA ）含量、骨髓细胞微核率和肝脏Bcl-2与Bax 凋亡蛋白的表达水平。

结果表明，OLE 中的多酚含量丰富，高达（57.55±2.98）mg/g ，可有效提高小鼠外周血细胞数量与血清SOD 、GSH-Px 活性，降低MDA 含量，抑制骨髓细胞微核的形成，调控肝脏凋亡蛋白的表达，对辐射损伤具有良好的防护作用。

关键词：橄榄叶多酚；辐射损伤；外周血细胞；氧化损伤；微核Polyphenol Analysis of Olive Leaf and Its Anti-radiation Effect on MiceSUN Mei-jun 1，KONG Hang-ru 2，ZHAO Jia-ying 1，ZHANG Yi-jin 1，LIN Li-ying 1，GUO Dong-bei 1，LI Lei 1*（1.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics ，Public Health School ，XiamenUniversity ，Xiamen 361102，Fujian ，China ；2.COFCO Nutrition and Health Research Institute ，Beijing 102200，China ）Abstract ：Olive leaf extract （OLE ）was extracted by using ultrasonic-assisted water extraction method and itspolyphenol content was determined.Its protective effect on the damage of mice induced by radiation was investi -gated as well.Different doses of OLE （150，500，1000mg/kg ）were given to mice before they were irradiated at the dose of 1Gy.The number of peripheral blood cells ，the activities of superoxide dismutase （SOD ），glu -tathione peroxidase （GSH-Px ），and the content of malondialdehyde （MDA ）of mice were measured.The bonemarrow micronucleus cells and the expression of apoptosis related proteins of liver were detected.The results showed that olive leaves were rich in polyphenols and the content was as high as （57.55±2.98）mg/g.OLE couldeffectively increase the number of peripheral blood cells and the activities of SOD and GSH-Px in serum ，re -duce the content of MDA ，inhibit the formation of micronucleus in bone marrow cells and regulate the expres -sion of apoptotic proteins.It exhibited protective effect on radiation-induced damage.Key words ：olive leaf polyphenols ；radiation damage ；peripheral blood cells ；oxidative damage ；micronucleus引文格式：孙美君，孔杭如，赵珈莹，等.橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究[J].食品研究与开发，2021，42（6）：44-48.SUN Meijun ，KONG Hangru ，ZHAO Jiaying ，et al.Polyphenol Analysis of Olive Leaf and Its Anti-radiation Effect on Mice[J].Food Research and Development ，2021，42（6）：44-48.辐射可以诱导细胞产生大量活性氧自由基（reac -tive oxygen species ，ROS ），破坏生物大分子，抑制抗氧化酶活性，增加脂质代谢产物，使机体处于氧化应激状态，从而诱发细胞凋亡、坏死[1]，导致机体出现急、慢性损伤。

小鼠精子冷冻保种协议（校内）甲方：乙方：厦门大学实验动物中心经甲、乙双方友好协商，对甲方品系小鼠的精子冷冻保种达成如下协议：一、责任和义务甲方：1、项目启动后，向乙方提交《小鼠精子冻存信息登记表》、《精子冻存小鼠基因型鉴定资料》，并保证提供的小鼠和资料全部合法。

2、提供3～8月龄基因型正确、符合精子冷冻条件的雄性小鼠3～5只（必须上要饲养在本中心屏障环境，雄鼠需有交配成功案例，单笼饲养一周后贴上蓝色转运标签，标签上注明“精子冻存”，并邮件告知。

甲方务必确保这些小鼠的基因型正确。

如果基因型出现错误，责任由甲方自行承担。

若乙方在冷冻过程中发现雄鼠精子不佳，甲方有义务重新提供。

3、负责复苏后小鼠基因型鉴定，自收到样品后，五个工作日内必须回复基因型测定结果。

如果逾期不能提供鉴定结果，需要陈述原因和提出延期申请。

超出30天时限未能提供鉴定结果且延期申请未得到乙方批准的，乙方有权处置已复苏的小鼠。

乙方：1、根据甲方需求，向甲方提供复苏验证所需的背景品系，包括C57BL/6J，BALB/c、FVB，其他背景雌鼠复苏时须由课题组自行提供雌鼠进行复苏验证等。

2、按要求完成冷冻及复检后，向甲方提交《小鼠精子冷冻情况反馈表》，经甲方确认后冷冻完成。

若甲方在未得到乙方通知前直接处理活体，造成的损失由甲方自行承担。

3、冷冻完成后每两年随机复苏检测冷冻状况，并向甲方报告品系精子状况，如果需要补充冷冻，则需要甲方配合鉴定基因型并支付成本费。

4、若甲方提交书面复苏要求，在支付复苏费用后启动复苏，原则上在3个月内向课题组提供每个品系至少3只阳性小鼠。

5、未经甲方书面允许，乙方不得以任何方式将冷冻的精子或复苏产生的小鼠及其后代提供给第三方。

二、费用及支付方式1、在协议签订后的3周内，甲方需支付精子冷冻操作费以及复苏验证费用：人民币贰仟叁佰元整（￥2300.00）。

2、乙方在收到费用后安排项目启动，甲方开始向乙方提供符合冷冻需求的雄性小鼠。

·临床研究·糖尿病新世界DIABETES NEW WORLD 糖尿病新世界2018年9月糖尿病是一类以高血糖及慢性血糖水平升高为特征的代谢性疾病[1]。

它会对人体的眼、肾、神经及心血管造成长期损害,导致功能不全和衰竭[2]。

研究糖尿病的治疗以及预防一直是科研工作者的重要任务。

糖尿病大鼠模型的应用对研究糖尿病具有不可替代的作用。

因此快速、准确的建立糖尿病大鼠模型具有重要的意义。

目前糖尿病大鼠造模方法以化学药物诱导最为常见。

常用的诱导药物包括四氧嘧啶(Alloxan,ALX)和链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)。

其中四氧嘧啶最为经济,但是受到造模方案的影响,其模型的成功率以及造模过程的死亡率相差较大。

所以运用有效的造模方案建立糖尿病大鼠模型尤为重要。

该文主要讨论的是四氧嘧啶诱导大鼠糖尿病模型过程中不同给药方案对造模成功率以及大鼠死亡率的影响,以寻找最佳的造模方案,现报道如下。

1资料与方法1.1实验动物及饲养条件SPF级SD大鼠,雄性,体重(180±200)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002。

实验动物饲养于厦门大学实验动物中心,实验动物使用许可证号为SYXK(闽)2013-0006。

1.2药品与试剂四氧嘧啶(美国Sigma公司),20%葡萄糖溶液(厦门大学实验动物中心配置);强生稳择易试纸(美国强生公司),强生稳择易型家用血糖仪(美国强生公司)。

1.3方法取SD大鼠70只,随机分为4组。

其中对照组10只,第1组20只,第2组20只,第3组20只。

分组后禁食4h(自由饮水),测空腹血糖,作为该组动物的基础血糖值。

随后禁食20h(自由饮水)按照各种给药方案制作大鼠高血糖模型。

7d后大鼠禁食4h,测血糖,血糖值10~25mmol/L为高血糖模型成功动物,30d后大鼠禁食4h,测血糖,血糖值10~25mmol/L为稳定高血糖模型动物。

世界中医药2222年12月第15卷第24期-3761-实验研究桂枝茯苓丸抗大鼠子宫肌瘤作用机制研究姚祺1郭辉1陈玲玲1陈秀萍1林东梅1陈山源2（1厦门大学附属福州第二医院，福州,350027；2福建中医药大学，福州,352122）摘要目的：探讨桂枝茯苓丸治疗子宫肌瘤模型大鼠的作用机制。

方法：60只成年雌性SD大鼠随机分为4组：分为空白（Control）组、模型（Hys）组、桂枝茯苓丸低剂量（G-L）组、桂枝茯苓丸高剂量（G-H）组，每组15只。

除假手术组外，其余3组均进行子宫肌瘤造模。

G-L组、G-H组分别接受浓度为1.32e/mL、2.64e/mL的桂枝茯苓丸混悬液1mL灌胃，其中Contrn）组及Hys组大鼠给予等剂量生理盐水灌胃，1次d,连续4周。

记录各组大鼠子宫及卵巢系数，HE染色观察子宫形态学变化，透射电镜观察子宫超微结构变化,ELISA法检测子宫组织E2、P、ER含量，Western Bint法检测子宫组织中PI3K/Akt信号通路蛋白表达情况。

结果：与Contrn）组比较，Hys组的子宫和卵巢系数、E2、P、ER的含量及抗凋亡蛋白PI3K、p-Akt表达增高（P<0.05），促凋亡蛋白Caspase-3表达减少（P<0.05）.G^组、G-H组上述指标均有所改善（P< 0.05），但G-H组明显优于G-L组（P<0.05）。

HE染色及透射电镜形态学观察提示Hye组大鼠子宫平滑肌增厚，细胞边界不清晰，细胞核固缩呈椭圆形或畸形，胞质內线粒体肿胀，部分嵴断裂消失，可见粗面內质网扩张，肌纤维排列紊乱无序，可见明显炎性细胞浸润；G-L组子宫平滑肌细胞排列较Hye组有序，平滑肌层仍有所增厚，炎性细胞浸润亦较Hye组组减少，细胞核较Hye组稍增大，线粒体肿胀和粗面內质网扩张减少；G-H组子宫平滑肌细胞排列较Hye组明显有序、紧密，仅见轻微炎性细胞浸润，平滑肌层无明显增生，且平滑肌细胞核较正常，线粒体及粗面內质网形态接近正常。

高蛋白饮食对肝硬化大鼠认知和大脑代谢的影响【摘要】目的探讨高蛋白饮食对胆总管结扎（BDL）致肝硬化模型大鼠运动功能、焦虑、记忆过程的影响。

方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术（SHAME）标准饮食对照组（Scon 组）、假手术（SHAME）接受高蛋白饮食的对照组（Scon-P）组、胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）标准饮食（Bcirr）组、胆总管结扎（BDL）接受高蛋白饮食的胆总管结扎组（Bcirr-P）。

选用一些行为实验检测大鼠运动功能、焦虑水平，评估参考记忆和空间记忆的损害。

使用细胞色素氧化酶免疫组化评估中枢神经系统区域的代谢活动。

结果旋转实验和十字迷宫四组均保持运动功能和正常焦虑水平；胆总管结扎（BDL）组不管何种饮食，空间记忆和主动回避行为均受损（P ＜0.01）。

然而，接受高蛋白饮食的肝硬化鼠在空间记忆任务中显示较长的逃脱潜伏期（P ＜0.01）。

胆总管结扎组海马和下丘脑显示能量活化不足（P ＜0.01）。

结论胆管结扎（BDL）高蛋白摄入组加重了肝硬化空间记忆障碍和主动学习任务，改变了运动和焦虑水平，且胆管结扎高蛋白饮食组并未影响到细胞色素氧化酶的细胞活性减退。

【关键词】肝昏迷；饮食；主动回避；空间参考记忆；细胞色素氧化酶；中枢神经系统肝性脑病是肝病患者发生的的中枢神经系统的并发征，肝性脑病的患者表现为神经肌肉、神经精神病学、行为异常的症状。

肝性脑病的患者认知功能的异常主要是以记忆力减退、注意力不集中、执行功能障碍和空间定向障碍为特点[1]。

运动症状也在肝性脑病患者中出现[2]。

智力活动异常主要是由于受损的肝脏不能代谢神经毒物，导致其在大脑的累积，从而影响神经递质和组织形态学细胞的变化，其中主要影响大脑星形胶质细胞[3]。

目前已经有许多动物实验模型已经建立并研究肝性脑病，尽量复制慢性肝硬化的临床特性、认知和运动症状。

几例临床研究报道慢性口服四氯化碳可引起学习和空间记忆相关的损害[1]。

违反实验动物中心安全运行管理制度处罚办法(试行)一、目的为保障实验动物的质量，落实动物实验室安全管理责任，维护课题组科研过程的正当权益，促进动物实验室的标准化、规范化运行，督促实验人员的良好行为，有效地杜绝违规事件发生，特制定本办法。

二、引用文件(一)《实验动物国家标准》【GB14925-2010】(二)《关于善待实验动物的指导性意见》【国科发财字（2006）398号】(三)《厦门大学实验动物管理办法（试行）》【(2014)厦大实1号】(四)《厦门大学实验室安全管理规定》【厦大设备（2013）2号】三、处罚范围在实验动物中心屏障环境、普通环境进行动物实验的所有相关人员。

四、处罚等级及要求(一)被扣0.5分者，口头警告，书面签字备案；(二)被扣0.5分以上、3分以下者，书面检查且上墙公示30天；(三)被扣3分（一次性或累积达到3分）者，导师签字的书面检查且上墙公示60天；(四)被扣5分（一次性或累积达到5分）者，导师签字的书面检查且上墙公示180天，并立即停门禁卡一个月，待重新参加培训合格后方可开通门禁卡；(五)所扣分值将被累积，当累积分值总数达10分（含）时，即日起三年内不得开卡。

五、处罚细则（一）违反以下任一条款扣0.5分1.进入多个实验室区域时，必须在门卫登记处填写每个区域的实验室房间号。

2.微信预约群必须严格执行预约时间顺序，特殊需求应征得该区管理人员同意方可实施。

3.屏障环境饲养间内的操作车不得当运输车，将其转运至屏障外区。

4.笼盒上的所有标签纸信息应按本中心管理要求规范书写。

5.在实验室饲养间或操作间操作时，不得无故不接听可以正常使用的电话。

6.使用普通环境G区手术室、操作室必须自觉登记，管好实验仪器和用品，及时清洁操作台面,把废弃物分类处理，离开时关好水电、门窗。

（二）违反以下条款中的任一小点操作规程扣1分1.进入屏障环境繁殖区（如A、B、C区）的操作规程（以下每小点违规扣1分）：①在进入淋浴房前，必须双手使用酒精喷壶消毒手部后再取淋浴时要用到的高压毛巾，高压毛巾不可随意与外界穿戴的衣服搭放在一起。

四氧嘧啶诱导大鼠糖尿病模型的建立目的研究四氧嘧啶造大鼠糖尿病模型的最适给药方案。

方法分别给大鼠不同的造模给药方案，在30 d内测定空腹血糖值，并统计实验期间动物的体重及存活率。

第1组给药方案：腹腔注射四氧嘧啶（160 mg/kg BW）;第2组给药方案：腹腔注射四氧嘧啶（120 mg/kg BW），24 h后第2次给药，腹腔注射四氧嘧啶（100 mg/kg BW）;第3组给药方案：腹腔注射四氧嘧啶（120 mg/kg BW），24 h后第2次给药，腹腔注射四氧嘧啶（100 mg/kg BW）。

第1次腹腔注射四氧嘧啶后，将饮水更换为20%葡萄糖溶液。

并维持高糖饮水1周。

对照组给予同等体积生理盐水。

结果第1组的大鼠存活率为60%，模型成功率为20%;第2组的大鼠存活率为65%，模型称功率为55%;第3组的大鼠存活率为100%，模型成功率为85%。

结论采用2次小剂量注射四氧嘧啶，并在给药后高糖饮水可以大大提高糖尿病大鼠造模的存活率及模型成功率。

标签：四氧嘧啶;双相血糖调节;大鼠;糖尿病糖尿病是一类以高血糖及慢性血糖水平升高为特征的代谢性疾病[1]。

它会对人体的眼、肾、神经及心血管造成长期损害，导致功能不全和衰竭[2]。

研究糖尿病的治疗以及预防一直是科研工作者的重要任务。

糖尿病大鼠模型的应用对研究糖尿病具有不可替代的作用。

因此快速、准确的建立糖尿病大鼠模型具有重要的意义。

目前糖尿病大鼠造模方法以化学药物诱导最为常见。

常用的诱导药物包括四氧嘧啶（Alloxan，ALX）和链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）。

其中四氧嘧啶最为经济，但是受到造模方案的影响，其模型的成功率以及造模过程的死亡率相差较大。

所以运用有效的造模方案建立糖尿病大鼠模型尤为重要。

该文主要讨论的是四氧嘧啶诱导大鼠糖尿病模型过程中不同给药方案对造模成功率以及大鼠死亡率的影响，以寻找最佳的造模方案，现报道如下。

1资料与方法1.1实验动物及饲养条件SPF级SD大鼠，雄性，体重（180±200）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2012-0002。

厦门大学实验动物中心《实验室使用xx》各课题组：翔安校区实验动物中心一期建筑面积7050m2，其中屏障环境4000m2、普通环境400m2，辅助区1900m2，二期建筑面积6500m2，其中屏障环境3800m2、辅助区2700m2,可饲养SPF级小鼠、大鼠，无菌级小鼠和普通级兔、豚鼠、小型猪、犬、猴等实验动物。

为了规范实验动物等级，合理使用功能实验室，避免实验动物的交叉污染，保证各课题组动物实验的正常进行，对进入实验动物中心的课题组和实验人员作出如下规定。

1、所有实验人员必须遵守国家《实验动物管理条例》、《实验动物国家标准》、《实验动物伦理审查指南》和《厦门大学实验动物管理办法（试行）》等相关标准和政策规定。

2、非本校课题组必须提供课题组长签字和加盖本单位公章的《实验室使用须知》后方能网上成功注册，随后实验人员方可向本课题组长注册。

本校课题组免交《实验室使用须知》。

未获得注册通过的课题组不得安排实验。

3、实验人员进入实验室前必须参加实验动物中心每月统一组织的专业理论知识培训、闭卷考试、环境设施现场培训，经实验动物中心考核合格后发放门禁卡（准入证）。

办理相关证件时需出示学生证、身份证等相关证件。

4、实验人员必须如实告知身体健康状况，如传染性疾病如肝炎、结核携带者，或者真菌等皮肤病患者均不得申请进入实验动物中心。

5、实验动物中心开放时间：正常工作日8:00～18:00，周末、寒暑假及法定节假日9:00～17:00。

若因实验需要，带上本课题组长签字的书面材料向实验动物中心有关老师申请，同意后方可进入实验室。

6、屏障环境SPF级实验动物室必须饲养具有相应生产许可证和质量合格证的实验动物。

普通环境饲养的动物必须从具有实验动物生产许可证或相关行业管理部门颁发的合法营业执照单位引进，大型动物必须提供动物烈性传染病和人畜共患病的免疫接种证明。

对于进口动物或质量来源不明的动物必须经隔离检疫净化合格后才能引进种源繁殖室。

高特异性人血清白蛋白化学发光免疫分析方法的建立张雅丽;袁伦志;王腾云;刘旋;吴坤;张军;程通;夏宁邵【摘要】人血清白蛋白(HSA)是人类肝脏功能的重要生物标志物.本研究旨在发展一种具有高度种属特异性和灵敏度的HSA化学发光免疫分析(HSA CLIA)定量检测方法.通过HSA免疫小鼠,制备了6株HSA鼠单克隆抗体;使用间接化学发光检测(Indirect-CLIA)和West blotting检测方法评价单抗对HSA的反应活性;使用免疫组织化学检测(IHC)和West blotting检测方法评价单抗的种属特异性;选择最佳的包被抗体和检测抗体配对;确定HSA-CLIA的定量线性和范围.West bloting和IHC方法中,4F5和5D2抗体反应性最强,且不与小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、猴、鸡等常见实验动物血清白蛋白交叉反应.以单抗5D2配合单抗4F5建立的HSA CLIA,线性范围达到122～31 250 pg/mL,可适用于多种样本的HSA定量检测.本研究发展的单克隆抗体和检测方法为HSA的特异性检测提供了重要工具和手段.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(053)003【总页数】6页(P424-429)【关键词】人血清白蛋白(HSA);单克隆抗体;种属特异性;化学发光免疫分析(CLIA)【作者】张雅丽;袁伦志;王腾云;刘旋;吴坤;张军;程通;夏宁邵【作者单位】厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102;厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,生命科学学院,福建厦门361102【正文语种】中文【中图分类】Q819人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是一种单链无糖基化的蛋白质，由585个氨基酸残基组成，分子质量为66.5ku［1］.HSA 由肝脏合成分泌，是循环系统中的重要蛋白，主要生理功能包括维持人体渗透压和血液总蛋白水平、运载亲水小分子、消除自由基、抗凝血、抗击炎症和感染等［2－3］.HSA 是肝脏功能的重要生物标志物，建立高特异性和高灵敏度的HSA检测方法具有重要的应用价值和意义.当前，HSA的检测方法主要有分光光度法［4］、荧光光度法［5］、极谱法［6］、酶联免疫吸附法［7－8］等.化学发光免疫分析方法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是近年来发展起来的新一代免疫检测技术，相比传统的检测方法具有灵敏度高、线性动力学范围宽广、光信号持续时间长等一系列的优势［9－11］.目前已有一些关于HSA的化学发光免疫分析方法（HSA－CLIA）研究的报道［12－15］，但对其检测性能尤其是种属特异性方面，尚缺乏系统性评估.本研究旨在发展一种具有高度种属特异性和高灵敏度的HSA－CLIA，同时对其检测性能进行系统评估.1 材料与方法1.1 试剂HSA标准品及纯化蛋白、显色底物、CLIA相关试剂由北京万泰生物药业有限公司惠赠；弗氏完全佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）干粉购于Sigma公司；DMEM 培养基干粉、1640培养基干粉、胎牛血清等细胞培养相关试剂均购于GIBCO公司；免疫组化超敏试剂盒购于福州迈新公司；碱性磷酸酶（AKP）、HRP标记的羊抗鼠（goat－anti－mouse，GAM）二抗购于PIERCE公司；商品化HSA 山羊多抗（goat anti HSA polyclonal antibody）购于Abcam公司；其他常规生化药品试剂购于国药集团化学试剂有限公司；小鼠血清（BALB／c）、大鼠（LOU／C）、兔（新西兰白兔）血清、鸡（海兰褐壳蛋鸡）血清采集自厦门大学实验动物中心及厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心饲养的实验动物；猴（恒河猴）血清采集自广西CDC灵长类动物中心；小牛血清及山羊血清购自北京万泰生物药业有限公司.1.2 用于免疫的实验小鼠BALB／c小鼠，均为雄性，6～8周龄，由厦门大学实验动物中心提供.1.3 杂交瘤细胞系的建立采用磷酸盐缓冲液（PBS）配制质量浓度为2mg／mL的HSA溶液与等体积佐剂充分混匀制成免疫原悬液，在BALB／c小鼠背部皮下多点免疫注射，第1次免疫用HSA加弗氏完全佐剂，第2和3次免疫用HSA加弗氏不完全佐剂，细胞融合前的加强免疫采用腹腔注射HSA（不加佐剂，加入等体积PBS）的方法；第1和2次免疫间隔3周，第2和3次免疫间隔2周，融合前3d加强免疫1次.每次免疫原剂量均为100μg／只，即100μL免疫原悬液／只.第3次免疫后7～10d从小鼠眶静脉采血，以间接酶联免疫吸附测定（ELISA）法测血清抗体效价后进行细胞融合.1.4 阳性克隆筛选HSA抗原以200ng／mL的工作浓度包板，以免疫小鼠血清1∶10（体积比）稀释液作为阳性对照，未融合的杂交骨髓瘤细胞培养液上清和正常的BALB／c小鼠血清作为阴性对照.样品37℃孵育1h后磷酸盐－吐温20缓冲液（PBST）洗板5次，每孔加入100μL 1∶5 000稀释的GAM－HRP二抗，37℃孵育30min，最后以酶标仪测定每孔OD450／OD620读值，凡测试孔OD450／OD620读值大于阴性对照孔读值的2倍及以上者，判断为阳性.1.5 杂交瘤细胞株的克隆化、培养、冻存、复苏、腹水纯化杂交瘤细胞株的克隆化、培养、冻存、复苏均按常规方法进行.腹水上清经50%（质量分数）硫胺沉淀后以原体积的PBS溶解，溶解上清以0.22μm的一次性滤器除去颗粒物后在AKTA explorer液相色谱纯化系统上使用MabSelect Sure LX 层析介质（GE Health公司）完成纯化.1.6 Western blotting检测SDS－PAGE上样量：HSA为5μg，其他各种属动物血清1∶10（体积比）稀释后各取1μL配成上样液，上样体积均为20μL.电泳结束后，凝胶进行Western blotting.转膜完成后，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于0.25%（质量分数）酪蛋白液中封闭，0.1%（质量分数，下同）PBST震荡洗涤5次后HSA单抗以1μg／mL浓度孵育1h，0.1%PBST震荡洗涤5次，GAM －碱性磷酸酶（AKP）以1μg／mL浓度孵育0.5h，0.1%PBST震荡洗涤5次，AP显色液显色.1.7 CLIA以pH值为7.4的20mmol／L PBS溶液稀释待包被抗体至1μg／mL浓度，100μL每孔包被化学发光检测板，包被条件为：4℃，12h.完成包被后以0.05%PBST溶液洗板一次，扣干；采用PBS配制的20%（质量分数）新生牛血清每孔200μL，37℃孵育封闭2h；封闭完成后PBST洗板1次，扣干待用.检测时每孔加入待测样品100μL，置于37℃孵育1h后，PBST洗板5次，扣干；每孔加入100μL二抗溶液37℃孵育30min，PBST洗板1次，加入化学发光液，于Orion II（Berthold）微孔板式化学发光仪上检测发光读值.1.8 免疫组织化学检测（IHC）待测组织于PBS配制的5%（体积分数）甲醛溶液固定24h，组织经脱水、石蜡包埋、切片、贴片、展片、烤片制成可用于检测的玻片样本，二甲苯浸泡10min体积分数分别为：100%、90%、80%、70%乙醇溶液梯度脱蜡（各浸泡5min），柠檬酸缓冲液中煮沸10min，甲醇配制的10%（体积分数）过氧化氢溶液浸泡10 min，PBS浸泡10min，非免疫山羊血清常温封闭孵育30min，PBS洗5遍（每次浸泡3min），一抗常温孵育30min，PBS洗5遍（每次浸泡3min），二抗常温孵育10min，PBS洗5遍（每次浸泡3min），三抗常温孵育8min，DAB染色2～3min，苏木素染色6～8min，5%（体积分数）盐酸乙醇分化，流水冲洗返蓝10min，体积分数分别为70%、80%、90%、100%的乙醇溶液梯度脱水（各浸泡5min），二甲苯浸泡10min，抽干玻片，中性树胶封片，镜检.2 实验结果2.1 抗HSA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立将HSA免疫BALB／c小鼠，经细胞融合和克隆化筛选获得6株可特异性结合HSA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为3D11、4F5、5D2、5E9、7B8和7D3.经单抗亚型鉴定，上述细胞株所产生的单克隆抗体均为小鼠IgG1亚型.以质量浓度为31.9mg／mL HSA样本进行梯度稀释包被化学发光板，采用间接化学发光检测方法（Indirect－CLIA）对6株HSA单抗的反应活性进行评估，结果显示如图1（a），单抗5D2和4F5即使在低浓度时也能显示出较强的反应读值，提示这2株抗体具有相对较好的反应活性.采用Western blotting方法对6株抗体进行检测评估，结果也同样显示单抗4F5和5D2的活性相对最佳（图1（b））.因此，在进一步的研究中，我们主要针对这2株单抗展开评估工作.图1 6株HSA单抗的反应活性评价Fig.1 Reactivity of 6strains of HSA monoclonal antibodies（mAbs）（a）6株单抗对HSA的反应性评估Indirect －CLIA检测结果曲线图，发光仪的原始数据通常以相对光单位（relative light unit，RLU）表示；（b）6株抗体对HSA反应性评估的 Western blotting检测结果，第1～9泳道上的HSA上样量分别是：3.19，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10，0.05，0.025，0.013μg.2.2 单抗4F5和5D2的种属特异性分析为进一步研究优选单抗4F5和5D2对不同种属动物的血清白蛋白的反应特异性，本研究采用Western blotting方法，评估了这2株单抗对小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、猴、鸡的血清白蛋白的交叉反应性.结果显示（图2（a）），商品化的对照HSA抗体对于上述不同种属来源的血清白蛋白存在不同程度的交叉反应性，而本研究制备的2株4F5和5D2单抗只特异性地识别HSA，而对其他种属来源的血清白蛋白无明显反应（2株单抗对小鼠血清和大鼠血清样本有微弱信号，可能是检测二抗带来的非特异性反应）.而采用此2株抗体对照商品化HSA抗体分别对人肝组织和鼠肝组织进行IHC的评估结果显示（图2（b）），商品化抗体对人肝和鼠肝组织均有很强的反应，而5D2和4F5则只对人肝组织可检测到强阳性信号，对鼠肝组织基本无阳性反应，说明5D2和4F5抗体可特异性检测人白蛋白，而不被小鼠白蛋白干扰.上述结果提示这2株抗体具有较好的种属特异性.2.3 HSA－CLIA抗体配对筛选采用以单抗5D2作为双抗夹心法HSA－CLIA的标记抗体，评估其搭配不同标记抗体：4F5－HRP、7B8－HRP、5E9－HRP、7D3－HRP、3D11－HRP（均为1μg／mL）对HSA的系列稀释样品检测能力.结果显示（图3），以4F5－HRP 为标记单抗具有较好的检测灵敏度，在HSA蛋白样品稀释1×106倍的情况下仍能检出.因此，本研究确定以HSA单抗5D2为捕获抗体和4F5－HRP为标记抗体建立HSA－CLIA.2.4 HSA－CLIA的定量线性和范围评价以抗体5D2作为包被抗体，HRP标记的4F5抗体作为标记抗体，经过反复系统调试和优化，最终建立了能精确定量的HSA－CLIA，采用系列稀释的纯化HSA对这一方法的定量线性和范围进行评估，结果显示本方法定量线性良好（R2＞0.99），最低检测限（信噪比（S／N）＞5视为阳性反应）约为122pg／mL，定量范围在122～31 250pg／mL（图4）.2.5 HSA－CLIA的重复性评估为了验证本研究建立的HSA－CLIA的检测结果的可重复性，选取20份人血清样本进行重复检测实验，包括进行批内重复（A与B，C与D）和批间重复（A与C、D，B与C、D）.结果显示（图5），多次批内检测和批间检测结果基本一致.提示本方法所获得检测结果具有良好的可重复性.3 讨论本研究采用HSA蛋白免疫BALB／c小鼠，筛选获得了6株HSA单克隆抗体，其中4F5和5D2 2株抗体具有相对较强的反应性，且不与小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、猴、鸡等常见的实验动物血清白蛋白发生交叉反应，提示这2株抗体具备较好的种属特异性.以5D2作为捕获抗体，4F5－HRP作为标记抗体建立的HSA－CLIA，其定量范围在122～31 250pg／mL，适用于各类对特异性和灵敏度求较高的样本的HSA定量检测.同时，上述单抗也可满足免疫荧光、免疫组化等针对HSA特异性检测的需求.当然，在进一步的研究中，还需要评估本研究发展的单克隆抗体及检测方法对更多不同物种（如马、犬、猫等）血清白蛋白的交叉反应性，以进一步明确其种属特异性和应用范围.图2 HSA单抗4F5和5D2的交叉反应性评估Fig.2 Cross－reactivity evaluation of HSA mAbs of 4F5and 5D2（a）单抗4F5和5D2对不同种类动物白蛋白反应活性的Western blotting检测结果（1.纯化人白蛋白，2.人血清，3.小鼠血清，4.大鼠血清，5.牛血清，6.兔血清，7.羊血清，8.猴血清，9.鸡血清）；（b）单抗4F5和5D2分别对人肝组织和小鼠肝脏组织反应性的IHC结果.图3 比较不同抗体配对对HSA的检测性能Fig.3 Comparsion of the detection performance in double－sandwich detection HSA in chemiluminescence immunoassay（CLIA）by using different antibodies pairs图4 HSA－CLIA的的定量线性和范围Fig.4 The detection range and linearity of HSA－CLIA（each sample was test 4repeats，data was expressed at mean plus SD）图5 HSA－CLIA的重复性考察Fig.5 Repeatability of the HSA－CLIA具有高度种属特异性的HSA单抗在人类肝脏动物嵌合模型构建中也有重要的应用需求［16］.人类肝脏动物嵌合模型是目前用于肝脏疾病发生机制、药物代谢等方面研究的一种重要动物模型.在人肝嵌合小鼠模型中，血清HSA是人肝细胞在鼠肝脏中存在的重要标志物，并且可以通过IHC方法定性检测鼠肝中的人肝细胞，也可以通过HSA－CLIA定量检测小鼠血液中的HSA含量，并以此估算小鼠肝脏内人肝细胞的嵌合率［17］.本研究发展的 HSA－CLIA方法具有高度种属特异性和灵敏度的特点，可以满足上述人类肝脏嵌合动物模型研究中对HSA的特异性检测需求，具有良好的应用潜力.【相关文献】［1］Minghetti P P，Ruffner D E，Kuang W J，et al.Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within q11－22of chromosome 4.［J］.J Biol Chem，1986，261（15）：6747－6757.［2］Quinlan G J，Martin G S，Evans T W.Albumin：biochemical properties and therapeutic potential［J］.Hepatology，2005，41（6）：1211－1219.［3］Arroyo V.Human serum albumin：not just a plasma volume expander［J］.Hepatology，2009，50（2）：355－357.［4］迟燕华，庄稼，董发勤，等.茜素红S光度法测定人血清白蛋白［J］.分析化学，1998，26（7）：911.［5］张明翠，汪乐余，李玲，等.新荧光试剂5－（4－羧基苯偶氮）－8－水杨酸缩氨基喹啉荧光增敏法测定人血清白蛋白质［J］.分析化学，2004，32（3）：342－344.［6］孙伟，王学亮，焦奎，等.以溴甲酚绿为电化学探针线性扫描极谱法测定人血清白蛋白［J］.分析化学，2005，33（1）：143－143.［7］Rajak P，Vijayalakshmi M A，Jayaprakash N S，et al.Production and characterization of monoclonal antibodies（mAbs）against human serum albumin（HSA）for the development of an immunoaffinity system with oriented anti－HSA mAbs as immobilized ligand［J］.J Pharm Biomed Anal，2013，5（79）：154－160.［8］Klooster R，Maassen B T，Stam J C，et al.Improved anti－IgG and HSA affinity ligands：clinical application of VHH antibody technology［J］.J Immunol Methods，2007，324（1／2）：1－12.［9］Liu M，Lin Z，Lin J M，et al.A review on applications of chemiluminescence detection in food analysis［J］.Anal Chim Acta，2010，670（1／2）：1－10.［10］Dodeigne C，Thunus L，Lejeune R.Chemiluminescence as diagnostic tool［J］.Talanta，2000，51（3）：415－439.［11］Bowie A R，Sanders M G，Worsfold P 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厦门大学研究、教案、测试用实验动物申请使用表申请项目名称：项目负责人（姓名）：联系电话：单位名称：电子邮箱：单位地址：传真：行政助理（姓名）：联系电话：动物研究合作单位如果无合适选项，请选此栏□若适用，请填写下列信息：□厦门大学所属单位□非厦门大学所属单位（如选此栏，请填写以下信息）单位名称单位地址项目负责人联系电话基金信息注：一份协议可能涵盖一个以上的基金项目选择“是”或“否”（申请中的基金不填项目号和起止时间）□否□是申请中的外部基金（提供申请首页复印件）□否□是获批的外部基金（提供申请首页复印件及厦门大学项目卡号）□否□是内部基金（提供厦门大学项目卡号）项目来源：项目号：项目起止时间：项目名称：项目来源：项目号：项目起止时间：项目名称：项目来源：项目号：项目起止时间：项目名称：该项目研究所使用的独特动物是否无法从商业途径获得的？□否□是如果是，在这些动物遭遇意外（如地震、火灾或人为破坏）而死亡时你是否有办法重新获取这些动物?□否□是（相应在下面选项中作出选择）. 如果不能，这种损失会对该项目产生多大的影响？. 如果可以，重新获取这些动物（如冻存的胚胎、从合作者处寻求等）需要多少经费？申请使用表填写指南厦门大学实验动物管理与伦理委员会是由生物、医学、药学、兽医、管理等不同专业背景的人员组成。

考虑到委员会成员不同的专业知识，请使用通俗易懂的语言进行描述。

. 简要描述所推荐项目的总体及具体目标。

. 简要描述所推荐项目与人类和或动物健康的关联，以及课题的社会意义。

. 进行动物实验的理由，以及“替代、减少、优化”的原则（; ; ）：对使用动物做实验提供科学论据是法律、道德和伦理的义务。

包括具体的需求物种、已认真考虑过减少使用动物及减少动物痛苦的实验方案。

基于上述前提，请填写下列信息。

. 该申请使用表所述程序中有没有不使用动物的替代方案？如果有，为何不考虑使用该替代方案？. 本实验在避免动物的疼痛和苦难方面（包括减少疼痛和危险性等）作了哪些尝试？. 解释所选物种为什么是实施该项目的最佳物种，如以解剖学、生理学或其他特征因素作为参考条件对物种的选择作出一个科学的解释。

厦门大学实验动物中心《实验室使用xx》各课题组：翔安校区实验动物中心一期建筑面积7050m2，其中屏障环境4000m2、普通环境400m2,辅助区1900m2,二期建筑面积6500m2,其中屏障环境3800m2、辅助区2700m2,可饲养SPF级小鼠、大鼠，无菌级小鼠和普通级兔、豚鼠、小型猪、犬、猴等实验动物。

为了规范实验动物等级，合理使用功能实验室，避免实验动物的交叉污染，保证各课题组动物实验的正常进行，对进入实验动物中心的课题组和实验人员作出如下规定。

1 、所有实验人员必须遵守国家《实验动物管理条例》、《实验动物国家标准》、《实验动物伦理审查指南》和《厦门大学实验动物管理办法（试行）》等相关标准和政策规定。

2、非本校课题组必须提供课题组长签字和加盖本单位公章的《实验室使用须知》后方能网上成功注册，随后实验人员方可向本课题组长注册。

本校课题组免交《实验室使用须知》。

未获得注册通过的课题组不得安排实验。

3、实验人员进入实验室前必须参加实验动物中心每月统一组织的专业理论知识培训、闭卷考试、环境设施现场培训，经实验动物中心考核合格后发放门禁卡（准入证）。

办理相关证件时需出示学生证、身份证等相关证件。

4、实验人员必须如实告知身体健康状况，如传染性疾病如肝炎、结核携带者，或者真菌等皮肤病患者均不得申请进入实验动物中心。

5、实验动物中心开放时间：正常工作日8:00〜18:00,周末、寒暑假及法定节假日9:00〜17:00。

若因实验需要，带上本课题组长签字的书面材料向实验动物中心有关老师申请,同意后方可进入实验室。

6、屏障环境SPF级实验动物室必须饲养具有相应生产许可证和质量合格证的实验动物。

普通环境饲养的动物必须从具有实验动物生产许可证或相关行业管理部门颁发的合法营业执照单位引进，大型动物必须提供动物烈性传染病和人畜共患病的免疫接种证明。

对于进口动物或质量来源不明的动物必须经隔离检疫净化合格后才能引进种源繁殖室。

10J Bengbu Med Coll,January2021,Vol.46,No.1［文章编号］1000-2200(2021)01-0010-05•基础医学•5-Fu在新一代结肠癌PDX模型中治疗剂量的研究刘靖1，陈战1，李鹏2，李迪2，涂永久1［摘要］目的:建立结直肠癌病人来源的异种移植(PDX)模型，探讨氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)的药效、毒性与给药剂量之间的关系。

方法:将新鲜的结直肠癌手术标本移植至免疫缺陷小鼠皮下，建立PDX模型并稳定传代,检测模型的溯源性;分别给予5、10、20、40、60mg/kg浓度的5-Fu,测量肿瘤体积、小鼠体质量变化和死亡情况等。

结果:成功建立PDX模型，溯源性高达99.96%。

5-Fu5、10、20、40、60mg/kg剂量组对应的肿瘤抑制率分别为33%、49%、68%、92%,100%。

其中,40mg/kg剂量组小鼠体质量剧减,60mg/kg剂量组死亡率达100%o结论：5-Fu的体内抑瘤效果及毒性与剂量密切相关,10~20mg/kg剂量的5-Fu较适合PDX模型的药效评价。

［关键词］结直肠肿瘤;氟尿嘧啶;病人来源肿瘤异种移植［中图法分类号］R735.3［文献标志码］A DOI：10.13898/ki.issn.1000-2200.2021 .01 .003Study on the therapeutic dose of5-fluorouracil in a new generation PDX model of colon cancerLIU Jing1,CHEN Zhan1,LI Peng2,LI Di2,TU Yong-jiu1(1.Department of General Surgery,Chenggong Hospital Affiliated to Xiamen University,Xiamen Fujian361000；2.Department of General Surgery,Xiang'an Hospital Affiliated to Xiamen University,Xiamen Fujian361102,China)［Abstract］Objective:To establish the patient-derived tumor xenografts(PDX)model of colorectal cancer(CRC),and explore the relationship among the anticancer effects,toxicity and dose of5-fluorouracil(5-Fu).Methods：The fresh human CRC tissues were subcutaneously transplanted into immunodeficient mice to establish a PDX model,and the traceability of the test model was detected. The mice were treated with5,10,20,40and60mg/kg of5-Fu,respectively,and the tumor volume,body mass and mortality were measured.Results：The PDX model was successfully established,and the traceability was99.96%.The tumor inhibition rates of5,10, 20,40and60mg/kg of5-Fu were33%,49%,68%,92%and100%,respectively.Among them,the body weight of mice significantly lost in40mg/kg dose group,and the mortality of60mg/kg dose group was100%.Conclusions:The efficacy and toxicity of5-Fu are closely related to the doses,and the10-20mg/kg of5-Fu is suitable for the efficacy evaluation of PDX model.［Key words］colorectal neoplasms；5-fluorouracil；patient-derived tumor xenografts结肠癌为临床常见的消化类疾病，属于恶性肿瘤之一，发病率较高［l］o早期结肠癌手术治疗后5年生存率可达90%~95%,而晚期仅有5%⑵。