流式抗体及荧光染料的选择

流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。

在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。

荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。

以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。

1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。

FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。

它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。

2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。

PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。

PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。

3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。

APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。

5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。

它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。

除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。

例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。

这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。

需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。

如何选择流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有很多种,我们如何来选择流式细胞仪测定的常用荧光染料呢？
首先要考虑，他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也不同,选择荧光染料时，必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长做为重点考虑。

发射光波长，如：氩离子气体激光管,它的发射光波488nm；
氦氖离子气体激光管发射光波长633nm；
488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）；
PE（藻红蛋白）
PI（碘化丙啶）
CY5（化青素）
preCP(叶绿素蛋白)
ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。

激发光和发射光波长，如下：
流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器
流式•细胞仪交流论坛：/forum-181-1.ht ml
荧光染料谱。

对于奋斗在科研一线的实验党来说，流式真是恨得牙齿直痒痒。

恨，是因为流式实在是坑太多，一堆的CD分子已经把人搞的晕头转向，又有电压、补偿、液流、滤光片、PMT这些概念傻傻分不清楚，而流式抗体怎么选择，再怎么搭配更是让人开始怀疑人生……经验总结：流式抗体选择秘诀由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。

因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。

1，流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

2，流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。

在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。

因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

3，流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。

以某仪器为例：PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。

FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。

用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。

如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道，流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。

各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

如实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。

切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。

因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。

常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

4，同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。

cik流式检测标准流式检测是一种常见的分析方法，通过将样品以液体形式通过流式细胞仪进行连续检测，可以快速、准确地获得样品中各种细胞的数量、类型及其相关信息。

Cik即Checks in the Kitchen的缩写，是一种流式检测标准，旨在规范流式细胞仪的操作和数据分析，提高流式检测的准确性和可重复性。

Cik流式检测标准的主要内容包括以下几个方面：仪器校准、样品制备、试剂选择、数据获取和数据分析。

下面将分别对这些方面进行详细讨论。

仪器校准是确保流式细胞仪正常工作和数据准确性的重要步骤。

在进行流式检测之前，需要校准仪器的光源、流速、压力等参数。

光源的校准要求使用标准颜色球或荧光微粒，根据其颜色和荧光信号调整仪器的光谱和增益。

同时，也需要检查流速和压力的稳定性，确保流式细胞仪的流速和施加压力在正常范围内。

样品制备是流式检测的关键步骤之一。

样品制备要求样品细胞以单个细胞为单位，在流式细胞仪采集之前进行适当的分散处理。

分散处理可以通过酶消化、机械分散等方法来实现，以确保样品中的细胞能够均匀分散，并且不会影响细胞的形态和功能。

此外，对于复杂样品，如全血样品，还需要进行红细胞溶解处理，以避免红细胞对后续流式检测结果的干扰。

试剂选择是流式检测中的重要环节。

在选择试剂时，需要根据实验目的和样品特性来确定合适的标记抗体、荧光染料和控制物质。

标记抗体和荧光染料的选择应考虑到其与目标细胞表面抗原的亲和力和特异性，以及其在流式细胞仪中的检测灵敏度和稳定性。

控制物质的选择应确保其与待检测样品相似，以提供准确的负对照和阳性对照。

同时，还需要对试剂进行质量控制，确保试剂的稳定性和纯度符合要求。

数据获取是流式检测过程中的核心环节。

在进行数据获取前，需要根据实验需求设置合适的检测参数，如激发波长、荧光通道和激光功率等。

此外，还需要根据样品特性和目标细胞的表达水平来确定数据采集时的事件数目，以确保获得足够的数据进行准确的分析和解释。

免疫细胞流式分选技巧一、标记抗体选择选择特异性识别目标免疫细胞的抗体是流式分选的第一步。

确保所选抗体与目标细胞表面抗原具有高亲和力和特异性结合的能力。

对于初次筛选，建议采用多参数标记，以便更准确地识别和区分不同细胞亚群。

二、细胞样本处理在开始流式分选之前，对收集的细胞样本进行适当的处理，包括离心、洗涤和重悬浮，以去除杂质和红细胞。

根据需要，可以采用特定的酶或化学物质对细胞进行消化或溶解，以促进抗体与细胞表面抗原的结合。

三、荧光染料选择选择适合激发波长和光谱特性的荧光染料，以确保在流式分选中获得最佳的信号强度和特异性。

荧光染料应与所用抗体结合，且荧光信号应与背景噪声具有良好的分离度。

四、流速和压力控制流速和压力是影响流式分选效果的关键因素。

过高的流速可能导致细胞无法充分与抗体结合，而过高的压力可能导致细胞变形或破裂。

根据所用仪器和抗体，合理设置流速和压力，以确保最佳的分选效果。

五、检测仪器校准定期对流式分选仪器进行校准，以确保数据的准确性和可靠性。

校准通常涉及使用已知细胞标准品来验证仪器性能，包括光电倍增管（PMT）的校准和流动池的清洁与校准。

六、数据分析与解读使用适当的软件对流式数据进行采集、分析和解读。

根据实验目的和抗体标记选择，可以采用不同的数据分析方法，如聚类分析、细胞计数、定量分析等。

正确解读数据并识别特定细胞亚群是流式分选的关键步骤。

七、阴性对照设置设置阴性对照是排除非特异性结合和背景噪声的重要步骤。

常用的阴性对照包括未标记细胞、同型对照抗体和荧光染料自发荧光。

通过比较实验组与阴性对照，可以更准确地评估目标细胞的特异性标记。

八、实验室内质控为了确保流式分选的稳定性和准确性，实施实验室内质控至关重要。

质控措施包括试剂质量控制、仪器校准、数据标准化以及实验室内比对等。

此外，应定期对流式分选结果进行验证，以确保数据的可靠性。

九、实验重复性验证重复性验证是评估流式分选实验可靠性的重要环节。

通过在相同条件下进行多次实验，可以评估实验方法的可重复性。

流式细胞分选（Flow Cytometry Cell Sorting）是一种用于分离和纯化特定细胞亚群的技术，其中抗体起到关键的作用。

以下是流式细胞分选抗体的原理：
标记抗体选择：首先，需要选择合适的抗体来标记目标细胞或目标细胞表面的特定分子。

这些抗体通常与荧光染料或其他标记物结合，以使标记的细胞在流式细胞仪中可视化。

光散射和荧光检测：标记后的细胞通过流式细胞仪，其在通过激光束时会散射或发射特定波长的荧光信号。

光散射用于测量细胞的大小和复杂度，而荧光检测用于检测标记抗体的荧光信号。

细胞分选：流式细胞仪根据标记的细胞的特定荧光信号，通过流式细胞排序装置将目标细胞与非目标细胞进行分离。

分选过程通常基于细胞荧光信号的阈值设定，将目标细胞与非目标细胞分开。

细胞收集：经过分选的细胞会根据需要进行收集，以获取纯化的目标细胞亚群。

抗体在流式细胞分选中起到了关键的作用，通过与目标细胞表面的特定分子结合，实现对特定细胞亚群的分离和纯化。

这种技术在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用，可以用于研究细胞亚群的功能、分析疾病机制以及进行细胞治疗等领域。

流式抗体制备流式抗体制备是一种用于检测和分析细胞表面标记物的重要技术。

通过结合单克隆抗体和荧光染料，流式抗体制备可以提供对特定蛋白质在细胞表面的定量和定位信息。

本文将介绍流式抗体制备的原理、步骤和应用。

一、原理流式抗体制备的原理基于免疫学。

首先，需要选择适当的单克隆抗体，该抗体能够特异性结合到目标蛋白质。

然后，单克隆抗体与荧光染料结合，形成流式抗体。

荧光染料会发出荧光信号，用于检测和分析细胞表面标记物。

二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样品收集并制备成单细胞悬浮液。

2. 抗体选择：根据所需检测的标记物选择适当的单克隆抗体。

3. 抗体结合：将单克隆抗体和荧光染料按照比例混合，使其结合成流式抗体。

4. 抗体染色：将流式抗体加入细胞悬浮液中，使其与目标蛋白质结合。

5. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体。

6. 流式细胞分析：使用流式细胞仪对样品进行分析，检测和定量目标蛋白质的表达水平。

三、应用流式抗体制备在许多生物学研究领域有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用示例：1. 细胞免疫表型：流式抗体制备可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达水平，从而帮助鉴定不同细胞类型和亚群。

2. 免疫治疗监测：流式抗体制备可以用于监测免疫治疗中特定免疫标记物的变化，以评估治疗效果。

3. 癌症研究：流式抗体制备可以用于检测和定量癌细胞表面标记物，从而帮助诊断和研究癌症。

4. 免疫疫苗研发：流式抗体制备可以用于筛选和评估潜在疫苗候选物的免疫原性。

总结流式抗体制备是一种重要的细胞分析技术，通过结合单克隆抗体和荧光染料，可以定量和定位细胞表面标记物。

该技术在细胞免疫表型、免疫治疗监测、癌症研究和免疫疫苗研发等领域有着广泛的应用。

随着技术的不断发展，流式抗体制备将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。

一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。

5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。

应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4•7H2O 2gKCl 8gMgCl•6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4•12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。

3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。

4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。

5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。

5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。

6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

1、蓝色（350-450nm处激发）CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等----亮蓝和紫外光激发。

CF350是类似于Alexa Fluor 350和传统荧光染料AMCA的蓝色荧光染料，CF350的荧光强度高于Alexa Fluor350、AMCA，吸附在蛋白上的荧光超过50%，水溶性更好，耐光性非常优秀亮，更容易与现有的绿色荧光基团区分。

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405 ----近乎完美的匹配蓝色二极管激光器。

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405与近来使用的荧光显微镜和流式细胞仪405nm;谱线的蓝色二极管激光器完美的匹配。

在流式细胞仪上的分析结果显示CF 405S/ CF 405 M荧光信号强度高于Alexa Fluor 405染料1.7倍。

2、绿色（488nm处激发）CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----针对488nm 氩离子激光器的绿色荧光染料。

以上染料其标记的抗体蛋白适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪，流式细胞仪的FL1通道检测，或者可用于荧光显微镜技术。

CF 488A最低限度的带电量降低了与抗体耦联物的非特异性结合，在红色通道溢出少于Alexa Fluor 488，耐光性好、水溶性好和pH 不敏感，良好的稳定性和活性染料的标记率。

Alexa Fluor 488在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4~10）；FITC激发波长488nm，最大发射波长525nm，缺点：荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

3、橙红色（543-555nm处激发）CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550, Cy 3, DyLight 549, Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色荧光染料；CF ™543 荧光条带明亮，耐光，水溶性好，确保了CF 543染料与抗体的耦联物保持优异的水溶性，为该波段最亮的橙色荧光染料。

如何选择合适的流式抗体随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。

流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体，优宁维交给您方法：第一：满足所需抗体的基本要求（抗原、识别种属、能用于流式实验）①目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，确定检测指标；②识别种属：严格按照样本种属来源进行选择，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；③可用于流式实验,说明书中明确标注经FC 实验测试，最好有实验数据图和用量说明；在查询抗体时这三要素是抗体查询必需填写项，下面是正确示范案例图1（参考优宁维官网高级查询）流式微信公众号：流式专家或UNIV-FCMsolution图1第二：确定流式细胞仪的配置（激光器+探测器）图2任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱：第一个是激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。

–吸收波峰（最大吸收波长）。

第二个是Ex-Max 发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。

–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长。

（如图2）那么荧光素跟我们的流式抗体选择有什么关系？在设计流式配色方案前，根据可能需要同时检测指标的多少，先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：①激发器：常见的流式细胞仪有 405，488nm 和 635nm 三个激光器，不同流式仪器激光器配置不同，但有些机器在购买时只装了一个激光器，需要注意的是，型号相同的机器也未必激光配置相同;激光器是跟荧光素的激发波长相关，所选择荧光素一定是流式仪器激光激发范围内的。

【技术资料】多⾊流式实验荧光素的选择近⼗年来流式细胞仪已经成为临床医⽣、免疫学家和细胞⽣物学家必不可少的⼯具，这项技术在不断进步。

流式细胞仪的多参数细胞分析这⼀独特的功能让⼤多数细胞分析成为了可能。

Coon⾸先提出了荧光抗体标记细胞内的⽬的蛋⽩技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单⼀的细胞表⾯标志物来确定，使⽤的单抗和荧光素很受限制。

基因表达技术的诞⽣和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。

1. 常⽤荧光素的种类及特性1）. FITC（Fluorescein）⼜称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；FITC的最⼤发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。

2). PE（R-Phycoerythrin）⼜称藻红蛋⽩，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE的最⼤发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。

3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR⼜名ECD，是由PE和TexasRed（TR）组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-TR的最⼤发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

4). PI（PropidiumIodide）⼜称碘化丙啶，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PI的最⼤发射波长为617nm。

在流式细胞仪的FL3通道检测。

5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）⼜称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最⼤发射波长为670nm，在流式细胞仪上⽤FL3通道检测；PE-Cy5标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

流式细胞术中应⽤的荧光染料介绍当我们在进⾏多⾊流式分析的时候，对分析成功的⼀个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。

通常会有很多可⾏的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。

对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪⽐相差四到六倍都取决于荧光素的使⽤。

相对的荧光强度也取决于使⽤的仪器。

⾼密度表达的抗原我们可以应⽤任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应⽤⾼信噪⽐⾼的荧光素，譬如PE或者APC标记的抗体来充分检测分离出阳性表达的细胞与阴性表达的细胞。

⾃发荧光个别的细胞有着他们各⾃特异性⽔平的⾃发荧光（荧光信号产⽣于他们⾃⾝）。

当在全波长荧光通道中进⾏观察的时候，⾃发荧光信号在长波长（>600nm）明显的降低。

对于有较⾼⽔平⾃发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使⽤较⾼发射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有⼀个较好信噪⽐的结果。

对于那些不是有较多⾃发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使⽤FITC 标记的抗体了。

以下为各种常⽤荧光素介绍：Alexa Fluor 488 has a spectrum almost identical to that of fluorescein isothiocyanate (FITC), but with extraordinary photostability. Because of this photostability, it has become a choice for fluorescent microscopy applications and has become popular in cytometry applications. It is detected in the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. Unlike other fluorochromes with similar emission spectra, Alexa Fluor 488 is pH insensitive over a broad range.Alexa Fluor 633 is a practical alternative to APC as well as Cy5. Alexa Fluor 633 conjugates can be used in multi-color flow cytometry with instruments equipped with a second red laser or red diode. It is detected in the FL4 detector of the FACSCalibur. The FACScan cannot be used to detect Alexa Fluor 633 conjugates because the FACScan lacks a red laser or diode. Like other Alexa Fluor dyes, Alexa Fluor 633 exhibits uncommon photostability, making it an ideal choice for fluorescent microscopy.A great number of different Alexa Fluor dyes exist that are beyond the scope of this introductory fluorophore section. Many manufacturers sell directly-conjugated Alexa Fluor antibodies. Know that Molecular Probes' Zenon Antibody Labeling Kits, which are available for all of their Alexa Fluor dyes, make it possible to rapidly and quantitatively label antibodies from a purified antibody fraction or from a crude antibody preparation such as serum, ascites fluid or a hybridoma supernatant. See /servlets/publications?id=150 for specifics.Allophycocyanin (APC) is an accessory photosynthetic pigment found in blue-green algae. APC has 6 phycocyanobilin chromophores per molecule, which are similar in structure to phycoerythrobilin, the chromophore in phycoerythrin or PE. APC tandem dyes, APC-Cy5.5 and APC-Cy7, are also available. APC has a 650-nanometer wavelength absorption maximum and a 660-nanometer fluorescence emission maximum. APC can be used in flow cytometers equipped with dual lasers for multi-color analysis. Like Alexa Fluor 633, APC is excited using the helium-neon red diode laser (633 nanometers) of the FACSCalibur and is detected on the FL4 detector. APC cannot be detected on the FACScan as that instrument is not equipped with a red laser.APC-Cy7 is a tandem conjugate system that combines APC and a cyanine dye (Cy7) and has an absorption maximum at~650 nanometers. This tandem uses the efficiency of the fluorescence light energy transfer between the two fluorochromes. When excited by light from a helium-neon laser, the excited fluorochrome (APC) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength. The resulting fluorescent emission maximum is in the deep red at approximately 767 nanometers. APC-Cy7 run on a FACSCalibur results in dim expression because the FL4 detector's optical filter is centered for APC emission (660 nanometers) and not the longer red wavelengths excited with the helium-neon diode. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Carboxyfluorescein Diacetate (CFSE) can be used to track asynchronous cell division. Cell division results in sequential halving of the initial fluorescence, resulting in a cellular fluorescence histogram.The peaks labeled 1, 2, 3, 4 and 5 represent successive generations of CFSE-cultured cells.Cy3 and Cy5 are excited by the 488-nanometer line of an argon laser and the 633-nanometer line of a helium-neon diode or laser, respectively. These conjugates can be used in flow cytometry but typically do not give the fluorescence intensity comparable to that of PE or APC. Applications where a smaller dye is required are more appropriate for these dyes. These fluorochromes are well suited for fluorescent microscopy.Enhanced Cyan Fluorescent Protein (eCFP) cannot be analyzed using the FACScan or FACSCalibur as this molecule requires excitation in the violet range. The protein is easily detected using the violet laser of the LSRII, or the violet lines of the MoFlo's argon or krypton lasers. This molecule has an excitation maximum at 475 nanometers and is best excited using the MoFlo's 457nm line of the argon or argon-krypton mixed gas laser. Use of the 407nm violet laser of the LSRII will result in weak eCFP expression. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) can be excited at 488 nanometers with a peak emission at 509 nanometers and is detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. The MoFlo and LSRII are able to distinguish between concurrently expressing eGFP and eYFP cells if the proper optical filters and experimental controls exist. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins. Enhanced Yellow Fluorescent Protein (eYFP), a yellow-shifted variant of the eGFP molecule, is also excited at 488 nanometers with a peak emission at 535 nanometers and is also detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Fluorescein isothiocyanate (FITC) is currently the most commonly used fluorescent dye for flow cytometry analysis. When excited at 488 nanometers, FITC has a green emission that's usually collected at 530 nanometers, the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. FITC has a high quantum yield (efficiency of energy transfer from absorption to emission fluorescence) and approximately half of the absorbed photons are emitted as fluorescent light. For fluorescent microscopy applications, FITC is seldom used as it photobleaches rather quickly though in flow cytometry applications, its photobleaching effects are not observed due to a very brief interaction at the laser intercept. FITC is highly sensitive to pH extremes.Peridinin chlorophyll protein (PerCP) has a 677 nanometer maximum emission, red, when excited at 488 nanometers and is detected on the FL3 detector of the FACSCalibur or FACScan. A PerCP tandem dye is also available (PerCP-Cy5.5). PerCP is not suited for the high-powered lasing (>150mW) applications, such as on the MoFlo, due to its photobleaching characteristics. PerCP conjugates can only be obtained from Becton Dickinson and its subsidiary, Pharmingen. Phycoerythrin (PE or R-PE) has a huge absorption coefficient and almost perfect quantum efficiency. In vivo, it functions to transfer light energy to chlorophyll during photosynthesis. It is one of the brightest dyes used today and emits in theyellow/orange at about 570 nanometers. Those accustomed to fluorescent microscopy may not be familiar with this fluorochrome as it photobleaches rather quickly under a microscope.Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) is a tandem conjugate where PE is coupled to the cyan dye, Cy5. When excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength in the red at 670 nanometers. This tandem dye is known by a confusing myriad of names to include Becton Dickinson's CyChrome, Caltag and Sigma's Tri-Color, GIBCO's RED670, Coulter's PC5, and probably others. Other PE conjugates exist, e.g., PE-Cy5.5 and PE-Cy7, that will not be discussed in this introductory fluorophore section. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Phycoerythrin-Texas Red (PE-Texas Red) is a tandem conjugate where PE is coupled to Texas Red. Similar to other tandem conjuates, when excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the Texas Red molecule, which then fluoresces at a longer wavelength with a peak in the orange at 612 nanometers. This tandem is also known by other names such as Red 612 and ECD (Electron Coupled Dye). Know that PE-Texas Red conjugates run on the FACScan or FACSCalibur will result in dull expression due to the extant optical filters. This is not observed on the LSRII or MoFlo when equipped with the appropriate optical filters for this conjugate. There is considerable overlap of emission when running PE and PE-Texas Red specimens.Propidium Iodide (PI) is a membrane-impermeant dye that stains by nondiscriminately intercalating into every 4th or 5th nucleic acid base pair, binding both DNA and RNA. Once bound, PI undergoes a conformational change and becomes ~40 times brighter. Propidium iodide has a broad emission spectrum with a peak in the orange at 620 nanometers. A number of assays employ propidium iodide. Cells or nuclei with altered DNA content are identified by staining alcohol-fixed, RNAse-treated cells or nuclei with this dye (see below).The first peak (M1) on the left represents normal diploid cells. The next major peak (M2) represents tumor cells with increased DNA content and DNA index of 1.27. Propidium iodide can be combined with additional fluorescent antibodies that are specific for a unique cell population and allow for more accurate S phase analysis of multiple overlapping populations.Propidium iodide has also been employed for many years as a marker for viability as the disrupted membranes of dead cells allow the dye to pass freely to the nucleic acids. However, this dye is very sticky; it will stick to sample tubing and, given sufficient time exposure to living cells, living cells will appear to be propidium iodide positive. Given this dye's broad emission spectrum and its sticky properties, contemporary flow cytometry labs have replaced propidium iodide with other nucleic acid dyes, e.g., 7-AAD (listed below), TO-PRO-3, or DAPI, among many others, for viability measurements though propidium iodide remains the most commonly used dye for DNA content analysis.Texas Red has an excitation maximum in the yellow-orange range of the color spectrum; consequently, Texas Red cannot be excited on any of the benchtop analyzers in the core facility. It can, however, be detected using one of green laser lines of the MoFlo's argon laser but ideally using the yellow laser line of the MoFlo's krypton laser. When excited, Texas Red has an excitation maximum in the orange at 612 nanometers.7-Aminoactinomycin D (7-AAD), like propidium iodide, is a DNA intercalating dye but 7-AAD is specific for C-G base pairs. It is well suited for viability measurements and also for apoptosis experiments where it's paired with Annexin V. Unlike propidium iodide, this dye has minimal emission bleed from the FL3 detector into the FL2 (PE) detector on the FACSCalibur or FACScan. Whereas PI can be detected in either FL2 or FL3, though it is typically detected in FL2, of the FACScan or FACSCalibur, 7-AAD is detected in FL3.PE：Phycoerythrin 藻红蛋⽩；488nm，575nm（橙红）FITC，异硫氰酸荧光素 488nm，525nm（绿APC：英⽂全名：allophycocyanin，中⽂名：别藻青蛋⽩，最⼤吸收峰：650nm，最⼤发射荧光峰：660nm，适⽤于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。

PerCP-Cy5.5等常见流式抗体荧光染料研究在进行流式细胞仪多色分析时，如果想得到理想的分析结果，就需要选择好抗体的荧光搭配。

常考虑的影响因素有以下几点：1.荧光素的荧光强度：一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，靠的是抗体上结合的荧光素标记。

每一种荧光素的光量子释放能力不同，相对荧光强度不一样，一般用染色指数（staining index）来比较不同荧光标记的光信号强度。

染色指数是阳性信号和阴性信号差异与阴性峰分布宽度比值，是判断该荧光染料辨别弱阳性表达的能力。

因此，对于特定的单克隆抗体，由于使用了不同的荧光素标记，其阴性细胞核阳性细胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。

一般来讲，荧光信号由强到弱的的排序是：PE>APC>PE-Cy5>PERCP-Cy5.5>FITC>PERCP。

2.荧光素标记效率：抗体上标记荧光素的数量（F/P）值也会影响相对荧光强度。

每一个抗体上可标记几个FITC 或PERCP分子（通常为2-9个），而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。

FITC为小分子化合物，而PE，PERCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白。

受荧光标记物的化学性质要求限制，IGM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记，如FITC、TEXAS RED、Cy3和Cy5。

3.抗原表达丰度：高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高亮度的荧光素标记的抗体进行检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。

4.细胞自发荧光：每个细胞群体都带有不同水平的自发荧光，由于细胞的自发荧光在高波长范围里（>600nm）迅速降低，所以在检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射波长较长的荧光染料（比如APC）可以得到较好的检测结果。

5.非特异性结合有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异性结合，就会造成阴性细胞的荧光水平升高。

艾美捷常见流式抗体荧光染料相关产品推荐：PE [R-Phycoerythrin]255610mgPE-Cy5 Tandem26101mgPE-Cy5.5 Tandem26131mgPE-Cy7 Tandem26161mgPE-Cy5.5 Tandem蛋白/抗体标记试剂盒1316/1341 2 LabelingsAPC [Allophycocyanin]25541mgAPC-Cy5.5 Tandem26221mgAPC-Cy7 Tandem26251mgPerCP-Cy5.5 Tandem26501mgAPC-Cy5.5 Tandem 蛋白/抗体标记试剂盒1320 2 Lalelings。

流式细胞术的染料基本要求-概述说明以及解释1.引言1.1 概述流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，它可以快速、准确地检测和分析细胞中的各种组成成分。

在流式细胞术中，染料的选择和使用是非常关键的，它直接影响到实验的结果和准确性。

因此，了解染料的基本要求对于开展流式细胞术研究至关重要。

首先，染料的选择要符合实验的目的和需要。

不同的细胞成分需要使用不同的染料进行标记，比如细胞膜表面标志物需要使用荧光标记染料，细胞内的DNA或RNA则需要使用核色素染料进行标记。

因此，在选择染料时，需要根据实验的研究对象和要解决的科学问题来决定使用什么样的染料才能达到最佳效果。

其次，染料的浓度和处理方法也是十分重要的。

染料的浓度应该适中，过高或过低都会对实验结果产生影响。

浓度过高可能导致非特异性标记或背景信号过强，而浓度过低则可能导致信号弱化或者检测不到。

此外，还需要注意染料的稳定性，某些染料可能会受到光照、温度等因素的影响而失去活性，因此在实验前需要充分了解染料的储存和处理方法，以确保其在实验过程中的稳定性和准确性。

总之，流式细胞术的染料基本要求包括选择符合实验目的和需要的染料以及合理控制染料的浓度和处理方法。

只有在满足这些要求的前提下，才能确保流式细胞术实验的准确性和可靠性。

对于未来的研究，可以进一步研究和开发更为稳定和高效的染料，并探索更多新的染料应用于流式细胞术中，以提高该技术在细胞学研究中的应用和发展。

文章结构的设计是为了使文章内容有条理、清晰、易于阅读和理解。

在本文中，文章结构的设计主要围绕着流式细胞术的染料基本要求展开。

下面是文章结构的详细描述：1.2 文章结构本文主要由引言、正文和结论三个部分组成。

1. 引言部分简要介绍了流式细胞术以及染料在其中的作用。

首先，概述了流式细胞术在生物医学研究中的重要性和应用范围。

然后，概括性地说明了文章的整体结构，并指出了引言、正文和结论的内容和目的。

最后，阐述了本文的目的，即探讨流式细胞术中染料的基本要求。

流式抗体使用说明书
流式抗体使用说明书
一、简介
流式抗体是指能够识别和结合细胞表面蛋白的抗体，通常作为流式细
胞仪的重要试剂之一，广泛应用于免疫学和生物医学研究领域。

本说
明书旨在指导用户正确使用流式抗体，使实验结果更加可靠和准确。

二、试剂准备
1. 流式抗体样本应在常温下恢复至室温，并在保护环境下充分混合。

2. 流式抗体在低温条件下可以储存，但必须避免冻结。

3. 流式抗体缓冲液中如果有成份沉淀，应充分振荡以恢复其原始状态。

三、实验操作
1. 样本制备
准备单细胞悬液样本，通过细胞培养、组织分离、免疫学分离等方法，制备单个细胞浓度适宜的悬液样本。

2. 样本标记和处理
标记要研究的抗原，根据需要选用合适的荧光染料，加入至少两种用
于鉴定应答者的荧光染料。

3. 流式仪操作
将标记后的样本置入流式细胞仪中，通过仪器自动识别、筛选和分拣细胞，获取数据并进行分析。

四、实验注意事项
1. 实验前请确保已经充分理解并掌握仪器软件的操作方法。

2. 流式抗体对温度的敏感性较高，使用生物安全柜等保护环境，防止污染和暴露。

3. 实验中样本的处理和标记要按照流程操作，避免误差和偏差。

4. 注意流式仪参数的设置，如激光波长、增益和标准化，避免影响实验结果。

五、结论
本使用说明书主要阐述了流式抗体的使用方法和步骤，希望能够对实验者有一定帮助，确保实验结果的准确性和可靠性。

在实验操作中，需要认真细致，注意规范操作流程，以获得更加精确的数据和结论。