[收稿日期]2016鄄09鄄05[基金项目]上海中医药大学研究生“创新能力培养冶专项科研项目(教1812)[作者单位]上海中医药大学附属曙光医院肾病科,上海中医药大学中医肾病研究所,上海市中医临床重点实验室(14DZ2273200),上海201203[作者简介]吴燕升(1990-),女,博士研究生.[通信作者]高建东,博士研究生导师,教授.E鄄mail:gaojiandong@[文章编号]1000鄄2200(2017)10鄄1293鄄06·基础医学·2种建立慢性肾脏衰竭合并肾性贫血大鼠模型的方法比较
吴燕升,万摇强,史丽强,高建东[摘要]目的:比较5/6肾切除和腺嘌呤灌胃2种方法建立慢性肾脏衰竭(肾衰)合并肾性贫血模型对大鼠肾脏损伤的影响。方法:SD雄性大鼠20只,随机分为正常对照组和模型1、2、3组,各5只。正常对照组给予灭菌蒸馏水灌胃,每天2mL。模型1组采用5/6肾切除法制作大鼠肾衰模型,肾切除采取Platt法。模型2、3组均采用腺嘌呤灌胃法造模,模型2组给予大鼠腺嘌呤200mg·kg-1·d-1灌胃2周,第3周开始隔天灌胃,共计4周;模型3组予腺嘌呤300mg·kg-1·d-1灌胃10d,第11天起改为250mg·kg-1·d-1,连续灌胃11d,共计21d。实验第8周末,比较各组大鼠体质量、血压和血红蛋白及肾功能指标,观察大鼠肾脏病理学改变,并采用免疫组织化学法检测大鼠肾组织琢鄄平滑肌肌动蛋白、骨桥蛋白和玉型、芋型胶原蛋白表达。结果:模型2、3组大鼠体质量均明显低于正常对照组(P<0.01);各模型组血压均有不同程度升高(P<0.05~P<0.01)。与正常对照组比较,各模型组血红蛋白均明显降低(P<0.01),血肌酐和尿素氮均升高(P<0.05~P<0.01),模型3组血尿酸水平亦升高(P<0.05)。肉眼可见各模型组大鼠肾脏形态及色泽改变。且与正常对照组大鼠比较,各模型组琢鄄平滑肌肌动蛋白、骨桥蛋白表达均显著升高(P<0.01),玉、芋型胶原蛋白表达亦均升高(P<0.05~P<0.01)。结论:5/6肾切除法和腺嘌呤灌胃法均可制作慢性肾衰合并肾性贫血大鼠模型,可根据研究内容选择合适方法和造模药物剂量。[关键词]肾脏衰竭;肾性贫血;动物模型;5/6肾切除法;腺嘌呤灌胃法[中图法分类号]R692.5摇摇摇[文献标志码]A摇摇摇DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2017.10.001ComparisionoftwokindsofmethodsestabishingtheratmodelofchronicrenalfailurecomplicatedwithrenalanemiaWUYan鄄sheng,WANQiang,SHILi鄄qiang,GAOJian鄄dong(DepartmentofNephrology,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,TCMInstituteofKidneyDisease,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicineShanghaiKeyLaboratoryofTraditionalChineseClinicalMedicine,Shanghai201203,China)[Abstract]Objective:Tocomparetheeffectsbetween5/6nephrectomyandadenineirrigationinestablishingtheratmodelofchronicrenalfailurecomplicatedwithrenalanemiaonthekidneyfunctionofrats.Methods:Twentyratswererandomlydividedintothecontrolgroup,model1,2and3groups(5ratseachgroup).Thecontrolgroupwasirrigatedwith2mlsterilizeddistilledwatereveryday,Themodel1wasestablishedwithPlattmethod,themodel2wasestablishedwith200mg·kg-1·d-1adeninefor2weeks,thenonetimetwodaysfor2weeks,andthemodel3wereestablishedwith300mg·kg-1·d-1adeninefor10days,then250mg·kg-1·d-1adeninefor11days.After8weeksofexperiment,theparametersofthebodymass,bloodpressure,hemoglobinandrenalfunction,therenalpathologicalchanges,andtheexpressionsof琢鄄smoothmuscleactin,osteopontin,andtype玉and芋collageninkidneytissuedetectedbyimmunohistochemicalmethodbetweentwogroupswerecompared.Results:Thebodymassinmodel2and3groupswassignificantlylowerthanthatincontrolgroup(P<0.01).Thebloodpressureinfourgroupsincreasedinvaryingdegrees(P<0.05toP<0.01).Comparedwiththecontrolgroup,thelevelsofhemoglobininthreemodelgroupssignificnatlydecreased(P<0.01),thelevelsofserumcreatinineandureanitrogeninmodelgroupsincreased(P<0.05toP<0.01),andthelevelofofuricacidinmodel3groupincreased(P<0.05)paredwithcontrolgroup,thelevelsof琢鄄smoothmuscleactin,osteopontin,andtype玉and芋collageninthreemodelgroupssignificnatlyincreased(P<0.05toP<0.01).Conclusions:Both5/6nephrectomyandadeninecanbeusedtoestablishtheratmodelofchronicrenalfailurecomplicatedwithrenal摇摇anemia,andtheappropriatemethodanddrugdoseshouldbechosenaccordingtothepurposeoftheexperiment.[Keywords]renalfailure;renalanemia;animalmodel;5/6摇摇摇摇摇摇nephrectomy;adenineirrigation摇摇慢性肾脏病(CKD)已成为关系全球人民健康的重要疾病之一,尤其在终末期肾衰竭阶段,其严重并发症肾性贫血与心血管疾病、肾功能的急剧恶化和生存质量的下降密切相关。美国国立卫生研究院3921蚌埠医学院学报2017年10月第42卷第10期调查显示,CKD1~2期病人的贫血发生率<10%,CKD3期为20%~40%,CKD4期为50%~60%,而在CKD5期其贫血发生率高达70%以上[1]。肾性贫血能导致肾小球和肾小管-间质纤维化、肾小管萎缩的严重病理改变,直接加速肾衰竭进展。为了更好地了解慢性肾脏衰竭(肾衰)及肾功能衰竭的发病机制,为临床治疗提供科研指导,我们采用5/6肾切除和腺嘌呤灌胃2种方法制作慢性肾衰合并肾性贫血大鼠模型,比较其对大鼠肾脏损伤的影响。1摇材料与方法1.1摇实验动物摇SD雄性大鼠20只,体质量200~220g,购自西普尔必凯实验动物有限公司。上海中医药大学实验动物中心SPF级环境下喂养,12h昼夜循环照明,温度26益,湿度50%,自由摄食及饮水,适应性喂养1周后,随机分为正常对照组和模型1、2、3组,各5只。1.2摇试剂与药物摇腺嘌呤由Amresco公司提供(货号0183);HE(货号D006)及Masson(货号D026)染色试剂盒均由南京建成生物科技有限公司提供;免疫组织化学试剂盒由武汉博士德生物公司提供(货号10F30C);小鼠抗大鼠琢鄄平滑肌肌动蛋白(琢鄄SMA)(货号BM0002)和兔抗大鼠胶原玉(货号BA0325)、芋(货号BM1625)由武汉博士德生物公司提供;兔抗大鼠骨桥蛋白(OPN)(货号ab8448)由Abcam公司提供。1.3摇方法摇正常对照组给予灭菌蒸馏水灌胃,每天2mL。模型1组采用5/6肾切除法制作大鼠肾衰模型,肾切除采取Platt法,大鼠右侧卧位固定于恒温手术台,剃毛刀备皮后局部75%乙醇棉球擦拭消毒,左侧肋弓下约0.5cm处,脊柱左旁1cm开长约2.5cm切口,经后腹膜取肾,暴露左侧肾脏,分离肾包膜后切除左肾2/3,缝合,复位剩余左肾,1周后摘除右肾。模型2、3组均采用腺嘌呤灌胃法造模,模型2组给予大鼠腺嘌呤200mg·kg-1·d-1灌胃2周,第3周开始隔天灌胃,共计4周;模型3组予腺嘌呤300mg·kg-1·d-1灌胃10d,第11天起改为250mg·kg-1·d-1,连续灌胃11d,共计21d。所有动物造模完成后继续自由摄食饮水饲养,实验第8周末,尾动脉测量大鼠血压、体质量,然后戊巴比妥钠麻醉,经腹主动脉取血处死,留取肾脏标本备用分析。1.4摇检测指标摇(1)大鼠体质量及血压:处死前测量各组大鼠体质量和血压,其中血压采用清醒大鼠尾套法测定,在恒温环境下,将大鼠置于测量管套中露出尾部,血压尾套(北京软隆科技有限公司BP鄄98A型智能无创血压计)套于大鼠尾中部,记录4~6次尾部血压,取平均值。(2)血红蛋白(Hb)及肾功能指标:其中肾功能指标包括血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和血尿酸(SUA),均由上海中医药大学附属曙光医院检验科完成。(3)大鼠肾脏病理染色:淤HE染色。常规脱水,浸蜡,包埋制成蜡块,切片厚度为3mm,常规脱蜡,水化,苏木精染色5~8min,自来水冲洗玻片上多余染液,1%盐酸乙醇分色10s,自来水速洗3~5min,伊红染液染色30s,自来水洗3min,脱水,透明,中性树胶封片。于Masson染色。切片脱蜡至蒸馏水,Weigert铁苏木精染色8min,流水稍洗;盐酸乙醇分化,流水冲洗5min;丽春红酸性品红液染色5min,蒸馏水稍冲洗;1%磷钼酸水溶液处理5min;不经水洗,直接苯胺蓝液染色5min;1%冰醋酸处理1min;95%乙醇脱水;二甲苯透明;中性树胶封固。(4)大鼠肾组织琢鄄SMA、OPN和玉型、芋型胶原蛋白表达:采用免疫组织化学法检测。福尔马林固定石蜡包埋组织,切片厚度为3mm,置60益烤箱中烤干,二甲苯脱腊,梯度乙醇水化,3%H2O2浸泡后EDTA鄄柠檬酸钠抗原修复液修复,小牛血清白蛋白封闭,滴加一抗,4益冰箱过夜,PBS冲洗3次,滴加二抗,孵育1h,PBS冲洗3次,滴加SABC室温孵育20min,DAB染色30s,流水冲洗后苏木精复染10s,盐酸乙醇分化,流水冲洗,脱水,透明,封片镜检。采用Image鄄Pro6.0软件对图片进行积分吸光度分析。1.5摇统计学方法摇采用方差分析和q检验。2摇结果2.1摇各组大鼠体质量和血压比较摇经造模及自由饮食共8周后,正常对照组大鼠表现灵敏,饮食正常,皮毛致密有光泽,体质量增加较快;模型1组大鼠精神萎靡,毛色枯,但体质量仍增加;而模型2、3组大鼠均精神萎靡,食欲减退,体质量减轻,不喜活动,毛色枯槁无光泽,尤以模型3组明显。体质量和血压检测结果显示,模型2、3组大鼠体质量均明显低于正常对照组(P<0.01)(见表1);与正常对照组比较,模型1、2、3组收缩压(SBP)均较高(P<0.05~P<0.01),模型3组舒张压(DBP)升高(P<0.05),模型2、3组平均动脉压(MBP)亦均明显升高(P<0.01)(见表2)。4921JBengbuMedColl,October2017,Vol.42,No.10