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transwell实验原理与步骤

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transwell实验原理与步骤 1 / 41 / 4

一、 Transwell 小室制备

1. 无基质胶 Transwell 小室制备 ① 包被基底膜： 用 50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜的上室面， 4 ℃风干。假如需

要在下室面铺 FN 的话，可将 200 ul 枪头的尖端剪掉 ,汲取 FN 平均涂抹在小室的下边。用

胶原（ collagen ）的话，一般配成 0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。 ② 水化基底膜：

吸出培育板中节余液体，每孔加入 50ul 含 10g/LBSA 的无血清培育液， 37 ℃， 30min 。

还有 tianjin_glioma 战友供给的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的 Matrigel (3.9

ug/ul) 60- 80 μ l ( 注意体积不可以太大，以刚把聚碳酸酯膜浸润为最好 )，置 37 ℃ 30 min

使 Matrigel 聚合成凝胶。

2. 有基质胶的 Transwell 小室制备

Chemicon 企业的 ECM550 系列说明书要求，将小室放入培育板中，在上室加入 300 μl

预温的无血清培育基，室温下静置 15 － 30 min ，使基质胶再水化。再吸去节余培育液。

二、制备细胞悬液

① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12 － 24 h ，进一步去除血清的影响。 但这一步并

不是一定的。

② 消化细胞， 停止消化后离心弃去培育液， 用 PBS 洗 1－ 2 遍，用含 BSA 的无血清培育基

重悬。 调整细胞密度至 1-10 ×10 5，个人以为不要超出 5 ×10 5 。详细实验时采纳密度要自己

探索，因为不一样细胞，其侵袭能力是不一样的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多

过快，假如最后用计数法统计结果的话将难以计数； 而过少的话， 可能还没到检测的时间点，

全部的细胞都已穿过，所以最少也要保证在收样的时候，上室内还要有必定量的细胞存在。

个人以为， 比较组和办理尽量不要分开计数， 因为细胞数目的差别会严重影响实验结果。 如

果需要对细胞预办理而不得不分开计数， 那么计数必定要多重复几次， 力争正确， 尽量保证

比较组和办理组细胞密度一致。

三、接种细胞

① 取细胞悬液 100 － 200 μl加入

Transwell 小室，不一样企业的、不一样大小的 Transwell 小

室对细胞悬液量有不一样要求，请参照说明书。 24 孔板小室一般 200 μ l 。

② 24 孔板下室一般加入 500 μl含 FBS 或趋化因子的培育基，不一样的培育板加的量有不一样

要求， 详细请参照说明书。这里要特别注意的是， 基层培育液和小室间常会有气泡产生，一

旦产生气泡， 基层培育液的趋化作用就减弱甚至消逝了， 在种板的时候要特别留意， 一旦出

现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培育板。

③ 培育细胞：惯例培育 12 － 48 h （主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考

虑到细胞细胞侵袭力外，办理要素对细胞数目的影响也不可以忽略。

以我的课题为例， 我使用的药物不单会克制肿瘤细胞侵袭力， 还对细胞增殖有显然克制。 我

选择的药物浓度是用 MTT 挑选出的 72 h 的 IC50 。用这个浓度办理细胞， 24 h 内对细胞增

殖并没有显然克制，但 24 h 后，克制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做 Transwell ，

办理时间也一定限制在 24 h 内，不然一旦药物克制了细胞增殖或许引诱出凋亡，使办理组

细胞数目少于比较组， 那么就难以必定穿过膜的细胞比比较组少， 终究是因为侵袭被克制引

起，还是办理后细胞数目自己就比比较组少而惹起的了。

时间过长不可以够，相同，太短也不可以，因为细胞内会有必定量的 MMPs 储藏，短时间内可

能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被汲取进去，从而发挥作用，影响 MMPs 表达，

到最后开释到培育基中， 还需要一个过程。 时间点的选择可尽量长点， 也可选择多个时间点

研究时间依靠效应， 但前提是这个时间范围内细胞数目不可以有显然变化。 此外，我看到细胞

在小室内的形态不是正常培育贴壁的形态， 而是圆形的， 还是悬浮时的形态， 可是汇齐集成 团，所以看到细胞不正常贴壁也不重要张，是正常现象 在培育过程中， 膜下会渐渐有少许吝啬泡产生，这是正常现象，可不予办理，但我碰到过培

养一段时间后， 膜下出现了大气泡， 幸好实时发现， 不然结果将特别严重。 所以，个人建议，最好接种细胞后 1－ 2 h 把培育板从培育箱里取出来看看，确信没有大气泡产生。 transwell实验原理与步骤 2 / 42 / 4

四、结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法：

1. 直接计数法

（ 1 ）“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，能够附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。经过给细胞染色，可在镜下计数细胞

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台 ? 蓝染色、 Giemsa 染色、苏木精染色、伊红染色等。个人介绍采纳 0.1% 结晶紫染色，这种方法有以下优势： (1). 不需要固定细胞，直接染色即可。 (2).

配制简单方便。 (3). 染色后能够用 33% 醋酸脱色，将结晶紫完整洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上

570 nm 测其 OD 值，间接反应细胞数。个人以为这是结晶紫染 色最大的优势所在。 因为，固然经过正确的细胞计数， 常常穿过膜的细胞数仍难以正确控制，

可能某一批实验穿过的细胞会特别多， 致使细胞成堆， 这种状况下就难以计数了， 这种状况

下就能够用醋酸脱色后用酶标仪检测。 使用结晶紫染色要注意， 染色前要将膜风干， 不然可

能会染不上。

③ 细胞计数：我们使用的是 Leica DC 300F 正置显微镜进行察看和摄影，把 Transwell 小

室反过来底向上便可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。 也有许多人用手术刀将膜切下

后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就能够长久保留，可是这样做小室就成

了一次性的了，不免有点浪费。

取若干个视线计数细胞个数。论坛里一般采纳 3－ 5 个视线，也有人用 10 个，都是随机选

取，个人以为这样选择的视线带有很大的有时性， 也会掺进人为影响， 特别是计数视线较少

的时候。我选用 16 个视线，不是随机选择，而是有固定的地点。我们使用的显微镜所看到

的视线的直径恰好是 Chemicon 企业的 ECM550 系列小室底面膜的直径的 1/4 。不一样厂家

不一样型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人以为，摄影时还是应入选用固定的地点， 并选

择尽可能多的视线。

（2 ）“非贴壁”细胞计数

因为某些细胞自己的原由或某些膜的关系， 有时细胞在穿过膜后不可以附着在膜上， 而是掉进

下室。 这种状况我没有碰到过， 依据论坛里供给的经验， 能够采集基层培育液，用流式细胞

仪计数细胞量， 也可用细胞计数的方法直接在镜下计数， 个人以为 MTT 应当也是能够用的，

有兴趣的能够试一试看。

2. 间接计数法

间接计数法主要用于穿过细胞过多， 而没法经过计数获取正确的细胞数所采纳的方法， 与常

用的 MTT 实验是相同的原理。

（1）MTT 法

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

② 24 孔板中加入 500 μl含 0.5 mg/ml MTT的完整培育基，将小室置于此中，使膜淹没

在培育基中， 37 ℃ 4 h 后取出。

③ 24 孔板中加入 500 μ l DMSO 将，小室置于此中， 使膜淹没在 DMSO 中，振荡 10 min ，

使甲 ? 充足溶解。取出小室， 24 孔板于酶标仪上测 OD 值。

（2 ）荧光试剂检测

这种方法一般是与 Transwell 小室一同销售的，其原理与 MTT 法近似，是用一种荧光染料

染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。 Chemicon 的 ECM554 即属于这种。

（3 ）结晶紫检测

上文已说过，这里不再赘述，原理与 MTT 法也是近似的。但结晶紫染色还有个优点，就是 染色和脱色的过程其实不影响膜上细胞，在脱色后还可从头染色。 transwell实验原理与步骤 3 / 43 / 4

1. 1

Matrigel ： Becton Dickinson Compary, - 20

Tanswell plate ：Costar ,USA , # 3422 ,

℃ 保留；

聚碳酯膜微孔直径为

8μm；

苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。

1. 2 趋化因子的制备 取传代次日长势优秀的 NIH3T3 细胞 ,无血清培育基柔和漂

洗两次 ; 加入无血清培育基 ,37 ℃ ,5 %CO2 培育 24 h ～ 48h ，采集细胞培育上清； 4 ℃ ,12

000rpm 离心 ,10 min , 取上清； 0.22 μ m滤膜过滤除菌；分装 ,在 - 20 ℃ 保留。

1. 3

transwell 培育板准备 全部操作均需无菌操作。 -20 ℃保留的 Matrigel 在冰上保 2℃ ～

8℃ 留宿消融。 在冰上用预冷的枪头汲取 100μ l Matrigel 加入冰预冷的 300μ l 无血清培育基

中, 充足混均。取上述稀释的 Matrigel 25 μ加l入 transwell 板上室 , 覆盖整个聚碳酯

膜,37 ℃ ,30 min , 使 Matrigel 聚合成胶。 已铺好 Matrigel 的 transwell 培育板置于 37℃ 可保

存2 周。

1. 4

Matrigel 侵袭实验 (Matrigel Invasion Assay) 刺激后的各组细胞用 PBS 漂洗 3 次。以

惯例方法用无血清培育基制备单细胞悬液 ,5 ×105 个细胞 / ml , 每组细胞各分为两部分。 胎盘

兰拒染实验 ,细胞活力需大于 95 % 。Transwell 培育板上室加入 100μl 细胞悬液 ( 5 ×104 个 )

并加入无血清培育基 200 ul 。 Transwell 培育板下室加入 500μl 趋化因子 ,37 ℃ ,5 %CO2

培育 24 h 。用湿棉签轻轻擦去 Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。当心取出上室 ,用线

拴住 ,并做好标志 ,用冰预冷的甲醇固定 30 min 。苏木素染色 1 min 。梯度乙醇脱水

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transwell实验原理及步骤

transwell实验原理及步骤

transwell实验原理及步骤

Transwell实验是一种常见的物理隔离实验，它可以检测细胞分子的通透性，定量测定细胞的迁移习性。它具有优异的实验特性，可以在固定的薄膜上完成细胞迁移过程。因此，Transwell实验实际上可以应用于多种疾病的研究和药物筛选等研究领域。

Transwell实验是在薄膜上进行细胞迁移特性测定的实验，它的主要步骤分为三个步骤：准备样品、实验和数据处理。

第一步，准备样品，首先要选择一种不同的膜作为载体，膜的选择取决于要用到的分子的大小；其次，细胞株必须首先分离和培养；最后，加入可能影响细胞迁移的化学物质（如化合物、药物、特定酶或细胞因子）作为实验要素。

第二步，实验阶段，包括将膜放置在实验容器中，并将细胞分离出来放入上腔，用培养液洗刷，细胞从上腔渗透进下腔，移动距离便是细胞迁移距离，借助于荧光染料示踪，通过荧光显微镜观察细胞，进而计算细胞的迁移距离。

第三步，数据处理阶段，则需要统计和分析细胞迁移的定量和分布信息，这就需要使用数据处理软件进行分析与统计，如生物信息学的软件pacbase、minitab等，将细胞的迁移情况进行统计和处理，最终求出迁移距离和数量。

Transwell实验因其快速、高效、无损及准确等特点，已被广泛用于分析细胞迁移、免疫反应、肿瘤转移、信号转导等生物学过程中分子性能及功能的研究。

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤

实用标准文案

精彩文档 Transwell实验原理与操作步骤

Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable

supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate

membrane）。

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

transwell小室实验原理

transwell小室实验原理

Transwell小室实验是一种常用于细胞学研究中的实验方法，主要用于研究细胞迁移、侵袭、成血管和细胞-细胞相互作用等细胞生物学现象。本文将详细介绍Transwell小室实验的原理及其在细胞学研究中的应用。

一、Transwell小室实验原理

Transwell小室实验是通过一种特殊的小室装置进行的，该装置由两个分隔的小室组成，上下两个小室之间通过一片具有微孔的多孔膜相连。这片多孔膜的孔径可以根据实验需要进行选择，常见的孔径有3um、8um等。在实验过程中，我们将需要观察的细胞或细胞外基质放置在上小室中，而下小室中则向其添加一定浓度的化学物质或药物。待实验进行一定时间后，我们可以通过上下小室之间的多孔膜来观察细胞的迁移、侵袭或是其他相关现象。

在Transwell小室实验中，我们可以根据实验需要对多孔膜进行功能修饰，比如涂覆胶原蛋白、基质蛋白等物质，或是加入不同浓度的化学刺激物质，以模拟细胞在不同生理环境下的行为。这种设置能够更真实地反映细胞在体内的生理活动，进一步帮助我们理解细胞的生理与病理过程。

二、Transwell小室实验在细胞学研究中的应用

1.细胞迁移和侵袭研究

Transwell小室实验广泛应用于细胞迁移和侵袭研究中。我们可以将需要研究的细胞悬浮在上小室中，然后在下小室中添加诱导因子，比如趋化因子、血浆成分等，通过多孔膜对细胞进行筛选，并观察细胞在多孔膜上迁移扩散的情况。这种实验能够模拟体内细胞在不同环境中的迁移和侵袭过程，帮助我们更好地理解细胞在肿瘤转移、炎症反应等生理和病理过程中的行为。

2.成血管研究

Transwell小室实验也常用于细胞成血管相关的研究。我们可以在上小室中培养内皮细胞或其他与血管生成相关的细胞，然后在下小室中添加适当的生长因子或细胞因子，观察细胞在多孔膜上形成管状结构。这种实验方法有助于我们深入了解血管生成的分子机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路。

3.细胞-细胞相互作用研究

transwell细胞迁移实验

transwell细胞迁移实验

Transwell细胞迁移实验

引言

细胞迁移是生物学研究中的重要内容之一，也是许多疾病研究的关键环节。在许多生物学实验中，研究人员需要测量和评估细胞的迁移能力。而Transwell细胞迁移实验就是其中一种常用的方法。本文将介绍Transwell细胞迁移实验的原理、实验步骤以及数据分析。

原理

Transwell细胞迁移实验是通过将细胞悬浮液放置在Transwell膜上，然后观察和测量细胞通过膜的能力来评估细胞迁移能力。该实验通常使用腔体作为细胞迁移的模拟环境，而Transwell膜则起到筛选和隔离细胞的作用。

Transwell膜由许多孔隙组成，孔隙的直径可以根据实验需求设置。当细胞悬浮液被加入到Transwell膜的上腔时，由于细胞迁移能力，部分细胞将穿过膜孔和底腔进入下方。通过对底腔中的细胞数量进行计数或测量，可以确定细胞的迁移能力。

实验步骤

1. 准备细胞悬浮液：将需要研究的细胞培养至对数生长期，用PBS缓冲液洗涤细胞，然后用适当的培养基保持细胞的活力。

2. 调整细胞浓度：将细胞用培养基稀释至适当的细胞数目，一般为10000-50000个细胞/mL。

3. 准备Transwell膜：将Transwell膜放入装有培养基的96孔板中，静置30分钟使其和培养基充分接触。

4. 加入细胞悬浮液：将步骤2中的细胞悬浮液加入到Transwell膜的上腔中，确保每个孔都有足够的细胞数量。

5. 添加诱导剂：如需研究细胞对特定诱导剂的迁移能力，可以在底腔中加入含有诱导剂的培养基。

6. 孵育细胞：将装有Transwell膜的培养板放入培养箱中，根据实验需求进行孵育。通常孵育时间为6-24小时。

7. 细胞固定和染色：孵育结束后，用PBS缓冲液轻轻地洗涤Transwell膜上的细胞，然后用适当的方法固定细胞并染色。 8. 细胞计数：使用显微镜观察并计数Transwell膜底部的细胞数量。可以根据需要选择不同的显微镜放大倍数。