Transwell实验原理与操作步骤
Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable
supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate
membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：
（1）共培养体系：
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
transwell迁移实验步骤
Transwell迁移实验步骤包括：
1. 样品准备：准备细胞悬液，一般细胞浓度为1×10^6 cell/ml；
2. 把悬液放入Transwell迁移板中，一般每孔放500～1000 μl 悬液；
3. 加入迁移因子，如血清、培养基等；
4. 在上层室内加入诱导因子，如TNF-α等；
5. 将Transwell迁移板放入培养箱，一般温度为37℃，湿度为90%；
6. 培养时间在24～48小时，如果有特殊要求可以适当延长；
7. 收集下层室中的细胞，将其用于测定迁移能力；
8. 细胞迁移数量的检测，一般采用放射免疫测定、流式细胞仪检测；
9. 实验结果分析，计算迁移指数，观察曲线图，分析细胞迁移情况。;
1 - 4 细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL移液器及配套枪头，1.5 mL EP管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1. ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2. 将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3. 根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。 4. 把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5. 放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6. 消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7. 按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。 8. 若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9. 在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10. 在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11. 在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。 2 - 4 12. 清洗transwell，可以反复使用。 二、细胞侵袭实验 细胞迁移实验不需要ECM Gel包被，其余步骤一致。 实验原理： 多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane），膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0 µm。 将Transwell小室放入对应的培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 细胞迁移和侵袭实验常用8.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室运动，从而从多孔膜一侧穿过，贴壁于多孔膜的另一侧，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁移或者侵袭能力（圆形透明小孔为微孔）。 （注：迁移和侵袭是两个概念，迁移是指细胞的运动能力，而侵袭是细胞在运动的同时会分泌出消化ECM的蛋白，清除运动障碍，这个实验更能模拟人体内环境） 注意事项 1. ECM Gel（货号：E1270）由Sigma公司生产，来源于大鼠肉瘤的细胞外基质提取物，保存在-20℃，由于在室温中会快速凝固，不可逆，因此需要在冰上溶解和操作，同时一切要与ECM Gel接触的耗材也需要预冷，避免俩 3 - 4 者接触时温差较大引起ECM Gel凝固粘附，造成浪费。 2. 本组常用的Transwell是Millipore公司生产的8um悬挂式millicell（货号：Millipore PIEP12R48 Millicell Hanging Cell Culture 24 well PET 8um）。每次使用完后用0.25%胰酶浸泡膜底10 min去除贴底细胞，清洗，棉签温柔擦拭， 75%乙醇浸泡24h，晾干，使膜上粘附的细胞和染液完全洗脱，下次使用前紫外照射正反两面，各30 min，通常可以反复用3-5次 3. 制作ECM Gel使用液时，先加入培养基，再加入ECM Gel；同时在使用量的基础上多配置5-20 uL（使用量多就多配点），避免液体挂壁造成最后一次加样不够。 4. 加胶时，胶的量以刚好把胶浸湿为最好（24孔的millicell需要35-40uL），过厚细胞侵袭变慢，过少则失去侵袭实验的意义；完成后可轻轻地，均匀地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，这样可以避免因为胶的厚薄不均而引起的误差。 5. 凝固时间可以适当延长，但最好不要超过30min，防止液体挥发使gel凝固得过硬。 6. 通常先根据细胞的侵袭能力估计每孔小室加入的细胞数量，侵袭能力强的细胞（如231，CAF）每孔加入5,000个，那最后的细胞悬液应该制备成2.5x104 / mL，而侵袭能力弱的细胞（如MCF-7）可以提高细胞数量，达到10,000个，那最后的细胞悬液应该制备成5x104 / mL。上层加入细胞悬液后可轻轻地，均匀地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，避免细胞分布不均而引起细胞计数时中间多两边少。 7. 加入下室中的10%FBS是作为趋化因子诱导细胞运动，24孔板下室一般加入500µl含FBS的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，气泡处的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，小室在放入时倾斜缓慢放入（注意小室中的液体不要流出），可以 4 - 4 避免气泡。培养时间需要自己根据文献做预实验，寻找合适的时间点；时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，细胞数及处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，穿过的细胞数在100-200之间最好。棉签清洗时一定要轻柔，防止戳破多孔膜。 8. 结晶紫是细胞核染液，细胞大小不同，染色时间也有改变，染液放置的时间和浓度也会对染色时间有影响，需要自己掌握；最优的染色状态是细胞核颜色深，胞浆色浅。
肿瘤细胞侵袭试验
细胞侵袭实验用来研究肿瘤细胞和胞外基质(ECM)之间的相互作用。 ECM不仅为细胞提供了结构支架，同时也包含了许多细胞生存及生长过程中生物功能因子。细胞可以分泌一种酶，该酶能够降解EMC中特定的组分，从而使细胞 向化学引诱剂移动，或者直接形成一种生长的状态。EMC胶模仿体内细胞外基质ECM环境，包含了支撑细胞结构的最基本的组分。转移性肿瘤细胞由于其高迁移 和/或降解ECM的酶活从而表现出较强的侵袭性。
材料和仪器
1. EMC Gel基质胶(Sigma-Aldrich # E1270)
2. 12mm直径，8μm孔隙的细胞小室(Millipore #PI8P01250)
3. 人Human MDA-MB-231 cell (ATCC #HTB-26)
4. DMEM培养基(Invitrogen #10313-021)
5. 胎牛血清(ATCC #30-2020)
6. 胰酶/EDTA消化液(Invitrogen # 25200-056)
7. PBS (Invitrogen #14190-144)
8. 戊二醛(Sigma-Aldrich #G6257)
9. 乙醇(Sigma-Aldrich #459836)
10. 10. 结晶紫(Sigma-Aldrich C3886)
11. 11. 棉签
12. 12. 细胞培养仪：37 °C and 5% CO2
步骤
1. 细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。
2. 4 °C溶EMC胶过夜。
3. 将细胞小室Millicell insert 和培养板于4°C 预冷。
4. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释EMC胶至终浓度2 mg/ml
5. 注意：EMC胶终浓度根据细胞类型可调整。
