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骨髓间充质干细胞研究与应用概况

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骨髓间充质干细胞研究与应用概况

于雷;高俊玲

【摘 要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。

【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》

【年(卷),期】2018(020)002

【总页数】5页(P164-168)

【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中

【作 者】于雷;高俊玲

【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;

【正文语种】中 文

【中图分类】R329.2

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。因为MSC于骨髓中含量最多，所以通常所指的MSC即BMSCs。由于它们来自骨髓结构，又是支持造血干细胞生长的滋养层组成部分，因此也有人称其为骨髓基质干细胞。研究人员从骨骼肌、脂肪、脐带血、肺等组织中分离出MSC，相继应用于很多疾病模型当中，在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域的研究相当广泛，如今BMSCs已是最常研究的MSC之一[3]。

1 生物学特性

在相差显微镜下BMSCs与成纤维细胞很相似，呈梭形或纺锤形，体积较大。电镜下观察细胞核较大，内含少量细胞器，核质比大。细胞周期的研究表明，大多数细胞处于G0/G1期，经某些信号的诱导，可分化成为某种分化细胞，故其具有强大的分化增殖能力。有研究报道显示在体外培养的BMSCs增殖12代后仍可以保持正常染色体表型和端粒酶活性[4]。

BMSCs还可以分泌多种细胞因子如：白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-7(interleukin -7，IL-7)、白细胞介素-8(interleukin -8，IL-8)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor， M-CSF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)等，这些细胞因子可参与机体的多种调控。通过分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖等物质，在机体造血功能中发挥重要的作用[5]。在免疫调节方面，由于BMSCs无特异性表面标志，在细胞贴壁附着后不表达CD3、CD4、CD14、CD34、CD45等，也不表达主要组织相容性复合物分子(major histocompatibility complex，MHC)；较高水平表达MHC-Ⅰ类抗原而不表达MHC-Ⅱ类抗原和CD80，低表达CD86[6]，所以机体不易产生对外来BMSCs的免疫应答。通过静脉注射的方式植入BMSCs，试验受体并未发生免疫排斥反应，观察发现BMSCs在体内可长期存活、分化、迁移并发挥其重要的细胞功能。Wang[7]等研究BMSCs可能是通过抑制C3的活化，从而降低机体免疫排斥反应。Aggarwal[8]等将BMSCs和无关供者来源的外周血单个核细胞以1:10比例培养后，发现共培养组调节性T细胞比例增高，提示BMSCs可以通过提高调节性T细胞从而诱导免疫耐受。Ramasamy[9]等发现BMSCs对有丝分裂激活的CD4+T、CD8+T细胞有明显的抑制增殖作用，而通过流式细胞仪检测早期活化标志物并未发现很大变化，所以推论其免疫排斥较弱的原因之一可能是通过对细胞增殖的抑制作用实现的。这些研究显示了BMSCs在异体种植中有着重要的应用价值，为移植BMSCs提供了一定的理论依据。

2 分离、培养与鉴定

在成人骨髓中，BMSCs约占全骨髓有核细胞总数的0.001%～0.1%，数量比例极低，并且随着年龄的增加逐渐减少[10,11]。所以要想获得足量的BMSCs须通过分离、提取、扩增和纯化等手段。目前用于分离培养BMSCs的方法有主要有四种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法、细胞筛选法，其中以全骨髓贴壁法和密度梯度离心法较为常用。虽然细胞表面分子标记分选法、细胞筛选法分离提取的细胞纯度高，但相比其他两种方法，后两者技术操作难度大，成本高，故较少采用。密度梯度离心法是依据骨髓中各细胞成分的密度不同来筛选出来，此法得到的原代细胞纯度较贴壁筛选法高，但细胞活性差，细胞功能有退化。全骨髓贴壁培养法操作步骤简单，时间短，污染机会少，增殖快,很多实验中运用此法均能获得较稳定的实验结果。Li[12]等研究验证了用简单的粘附方法可以有效地富集高纯度的BMSCs，其表型特征及分化潜能都显示了干细胞的特征。分离出来的BMSCs需要在一定培养条件下才能生长增殖，在建立BMSCs培养环境时常用低糖型的DMEM，不同类型的胎牛血清对细胞的贴壁、增殖、分化等方面影响各不相同。另外，不同浓度的血清对培养体系也有差异。实际情况中，低糖DMEM加入约10%胎牛血清较有利于BMSCs的培养。过高的血清浓度会促进细胞增殖分化，使细胞老化，不利于BMSCs增殖生长。用纯度较高的血清培养，更有利于细胞的功能保留，其增殖速度也较快。过去的四十年里，BMSCs显示出相当大的治疗潜力，在众多生物医学学科中产生了越来越广泛的关注。然而，不同研究人员对其采用不同的分离和增殖的方法，所以研究成果之间也越来越难以进行比较，一定程度上阻碍了该领域的发展。为解决这个问题，国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出了三条最低的标准以定义人类BMSCs。首先，必须在标准培养条件下具有贴壁可塑性；第二，必须表达CD105、CD73、CD90并缺乏表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和人白细胞抗原-DR(human leukocyte

antigens-D-related，HLA-DR)表面分子；第三，必须具有在体外分化成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力[13]。虽然这些标准还有待完善，但相信用这样的方式将更方便研究人员之间的探讨与交流。

3 BMSCs治疗疾病的新进展

BMSCs作为一种新型的研究对象在基础研究和临床实践中有着诸多优点，其低免疫原性一定程度上避免了在自体/异体移植方面的免疫排斥。通常情况下只有在病理状态才能诱导激发强大的细胞更新能力。BMSCs可通过类似归巢作用的方式向特定的体内组织进行原位修复[14]。BMSCs已作为细胞治疗和基因治疗的种子细胞，广泛应用于神经病学、骨科学、心脏病学和血液病学等临床领域。由于BMSCs提取便利，易分离培养，排异反应不明显，能避免由伦理学问题而引起的争议，故可在很多疾病中作为细胞替代疗法的种子细胞。

3.1 BMSCs与缺血性脑卒中 Kim[15]等发现BMSCs可以同时减弱先天性和适应性免疫反应，减轻中枢神经系统损伤，减少局部缺血性脑卒中诱发强烈的炎症反应导致的白细胞向梗死区域募集。Zhang[16]等研究认为趋化因子(chemokine)CX3CR1活化Jak2-stat5alpha-ERK1/2信号，触发整联蛋白依赖的结构重组促使BMSCs向缺血损伤脑组织趋化性迁移，说明多因子共同作用影响BMSCs的迁移。Tsai[17]等为检测BMSCs分泌的神经营养因子的作用，取来自大鼠的BMSCs培养基对缺血卒中动物模型进行治疗，发现培养基能增强神经细胞之间的连接，在促进卒中后功能恢复等方面发挥效能。

3.2 BMSCs与肺纤维化 Guan[18]等发现在肺纤维化早期阶段，BMSCs可通过抑制前炎症信号通路和上调抗炎通路来保护受损的肺组织。Mei[19]等研究BMSCs能降低全身及肺部炎症反应，较大程度上降低炎症因子水平，促进炎症修复。最近Li[20]等通过修饰BMSCs用慢病毒转染方法过表达骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)基因，能显著降低经二氧化硅诱导处理的大鼠肺纤维化程度。这提示用BMP-7-BMSCs治疗方法可作为矽肺病的潜在治疗干预措施。另有研究结果表明，BMSCs对二氧化硅诱导的肺纤维化产生抗纤维化作用，可能主要与旁分泌机制有关，而不是分化作用[21]。

3.3 BMSCs与骨疾病 Daltro[22]等采用自体BMSCs移植治疗89例镰刀形红细胞合并股骨头早期坏死患者，随访5年发现BMSCs移植组的疼痛显著减轻，病程发展变慢。但是BMSCs移植治疗股骨头坏死最好应用在疾病的早期。Taketani[23]等研究同种异体骨髓移植，再用BMSCs移植治疗2例重症致死性低磷酸酯酶症：骨髓移植2周后，将BMSCs按1～2×106/kg静脉注射，2例分别接受4次和9次BMSCs注射。随访3年发现其骨骼发育状态均得到显著改善，但骨骼结构和速度依然异于正常儿童。同种异体BMSCs移植的治疗方法显著改善患者的身高、体重和四肢长度，提高患者的运动能力评分，延长存活时间。Dai[24]等进行了40例BMSCs移植治疗颈椎损伤造成的慢性完全脊髓损伤患者的随机对照研究，治疗组10例临床症状包括电刺激、轻触觉、针刺感觉和残余尿量都明显改善，且其中有9例创伤严重等级得到降低，神经电生理检测结果和临床症状改善结果一致；对照组中则无一例显著改善。

3.4 BMSCs与肝脏疾病 Xie[25]等研究表明干扰素-β抗原(interferon-β，INF-β)基因修饰的BMSCs可以有效地通过抑制AKT/FOXO3a途径减少肝癌细胞在体外和体内的增殖。Hang[26]等在急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)中发现，BMSCs分化为肝细胞可能不是主要的治疗作用，在损伤部位炎症因子刺激下，一方面，BMSCs凭借向损伤部位趋化的能力，通过血液循环迁移到受损部位参与修复；另一方面，BMSCs合成多种生长因子，以及具有可以抑制炎性应答的细胞因子，刺激内源性细胞增殖和血管增生等。Zhang[27]等发现BMSCs通过增加血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表达来改善急性肝衰竭，降低多形核细胞(polymorphonucleocyte，PMN)的浸润和功能，可能与核因子-κB激活的抑制有关，从而起到重要的抗炎和抗凋亡作用。

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人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用

人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用

人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用

肖宏涛 综述，刘 毅 审校

人脐带血间充质干细胞(HUCBMSCs)是一种具有全能干细胞特点的细胞，是中胚层发育的早期细胞，其形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似,具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等[1]。与骨髓相比，脐带血有更充足的来源，对供者无任何不良影响，其间充质干细胞更为原始，分化能力更强。因此脐带血间充质干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞成为组织工程的重要种子细胞。脐带血间充质干细胞现已成为继骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞后又一受众多学者关注的热点，本文就脐带血间充质干细胞的研究近况及其在脂肪组织工程中的应用做一综述。

1脐带血间充质干细胞的发现及其生物学特征

1.1 脐带血间充质干细胞的发现：在脐带血中是否存在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），研究初期有许多争议。Erices等[2]于2000年首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，但在培养的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞(Mesenehymal-like cells，MLC)，其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，其余22份培养出的均为破骨样细胞，同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。

Mareschi等[3]与上述意见不同，他们检测了35份骨髓和58份足月产脐血标本，以Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，脐血的贴壁细胞很快衰退，表达CD45、CD14、CD31等造血及内皮细胞的标志，他们还检测了通常由MSCs分泌的两种细胞因子IL-6、IL-11和通常由单核-巨噬细胞分泌的TNFα、TGFβ的mRNA表达，结果显示脐血的贴壁细胞表达IL-6、TNFα和TGFβ，不表达IL-11，进一步证明脐血中缺乏MSCs，由此他们得出结论脐血中贴壁的单个核细胞表现出造血细胞的形态特点而不是MSCs。Yu等[4]培养了中期妊娠(16～28周)的胎儿血和足月分娩的脐带血，前者可以得到MSCs，而后者只得到异质性的贴壁细胞，表达CD45，表明属于造血细胞。Karen Bieback等[5]则通过实验证明了足月妊娠产妇脐带血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分离与脐血采集量、保存时间、单个核细胞数以及是否发生凝血和溶血有关。Lee等[6]应用梯度离心法从脐带血中分离到间充质干细(MSCs),并对其性质进行了初步鉴定，再次证实脐带血中存在MSCs。

骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景

骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景

骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景

骨髓间充质干细胞的概念骨髓间充质干细胞 (Mesenchymalstemcells,MSCs) 是骨髓中的非造血干细胞 , 早期分离培养时 , 其外观呈成纤维细胞样而被称为“成纤维细胞集落形成单位 (Colony-formingunit-fibroblastic,CUF-F) ”或“骨髓基质成纤维细胞

(Marrowstromalfibroblasts,MSF) ”。随着研究的深入 , 人们发现其对骨髓血系细胞起支持诱导作用 , 可促进造血细胞克隆的形成 , 因而推测这种细胞可能是间质细胞的前体细胞 ,

又因其来自于骨髓基质 , 因而称其为“骨髓基质细胞

(Bonemarrowstromalcells,BMSCs) ”。近年来 , 因其在不同的诱导条件下能分化成成熟的间质细胞 , 如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞、血管内皮细胞等 , 又称其为“间充质干细胞”或“间充质祖细胞”。研究 MSC 的细胞周期发现 ,MSC 中有

90% 处于 Go/Gl 期 [1], 说明 MSC 具有高分化潜能。目前的研究显示 ,MSC 的终末分化有可能跨越胚层界限 , 超越传统意义上的分化为中胚层来源的间质细胞 , 而向实质细胞转化 , 如分化为心肌细胞、神经细胞等 , 这一研究成果不仅具有重大的理论意义 , 而且有着广泛的临床应用前景。 2 骨髓间充质干细胞的分离、培养骨髓中间充质干细胞的数量极少 , 成人骨髓平均 10 万个有核细胞中含有 1 个 , 且随着年龄的增加 , 细胞数量逐渐减少 , 因此 , 如何获取高纯度的 MSC 相当重要。常用的分离 MSC 的方法有全骨髓法和离心法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性 , 定期换液除去不贴壁细胞 , 如造血系细胞等 , 达到分离纯化 MSC 的目的。离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同 , 提取单核细胞进行贴壁培养。为了获得更高纯度的 MSC, 有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对 MSC 进行分离纯化 , 结果令人满意。 MSC 的培养采用常规的组织细胞培养方法 , 艾国平 [2] 的研究表明 , 选用 4 ～ 24h 贴壁的有核细胞进行传代培养最适宜 , 培养基中胎牛血清含量为 5% ～ 10%, 细胞接种密度为 (4 ～ 8) × 104/ml 最利于细胞生长 , 培养细胞在 3 ～

骨髓间充质干细胞及其临床应用前景

骨髓间充质干细胞及其临床应用前景

口腔颌面外科杂志０Ｑ　生箜　鲞箜　塑　骨髓间充质干细胞及其临床应用前景　ＢＯＮＥ　ＭＡＲＲＯＷ．ＤＥＲＩＶＥＤ　ＭＥＳＥＮＣＨＹＴＭＡＬ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＩＴＳ　ＰＲＯＳＰＥＣＴ　ＩＮ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ　康非吾，唐体发，温玉明　中图分类号：Ｒ　７８１．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—４９７９（２００２）０２—０１４３—０３　干细胞是近年来生物学上最具挑战性、也最有吸　引力的领域之一。其中造血干细胞（ＨＳＣ）已经应用　于临床，在治疗血液系统恶性疾病、遗传性免疫缺陷　等方面取得了显著的成就。除了造血干细胞以外，在　机体成熟组织中还存在非造血干细胞（如肌肉干细　胞、神经元干细胞、表皮层干细胞等），在机体受到外　伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化，产生　新的组织来替代它们，以保持机体的稳态平衡。骨髓　间充质干细胞（ＭＳＣ）位于骨髓的基质细胞系中，在体　外可以通过贴壁培养加以分离，分裂增殖能力强，可　以分化为多种结缔组织细胞（纤维、骨、软骨、腱、肌　肉、脂肪），并易于被外源基因转染且稳定表达，被认　为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞。因　此，骨髓ＭＳＣ已成为该领域研究的热点之一。　１骨髓ＭＳＣ的生物学特性　１．１骨髓ＭＳＣ的分离培养　最早在１８６７年，德国Ｃｏｈｎｈｅｉｍ报道，通过实验　推测骨髓内存在非造血功能的干细胞。１８６９年，Ｇｏｕ．　ｉｏｎ通过实验证实了骨髓具有成骨能力。在其后并没　有对其进行深入的研究，直到７０年代，人们才真正开　始了对骨髓的非造血干细胞（骨髓ＭＳＣ）进行进一步　的深入研究。１９７４年Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ将全骨髓在塑料培　养皿中培养，４ｈ后倒出非贴壁生长的细胞（事实上，　后来证实被丢弃的是造血干细胞ＨＳＣ及其造血前祖　细胞），贴壁生长的细胞（后来证实为骨髓ＭＳＣ）继续　培养，２～４天后细胞增殖加快，大部分为梭形，呈克　隆性生长，并在数代的培养后最终部分细胞分化为骨　及软骨细胞。１９８４年Ｏｗｅｎ首先将这种贴壁生长的　骨髓单核细胞定义为骨髓间充质干细胞ＭＳＣ。后许　多学者以此方法为基础，采用密度梯度离心等辅助手　段，不断提高间充质干细胞原代分离的效率，逐步探　索并建立了骨髓ＭＳＣ体外分离培养的方法¨．２　Ｊ。　１．２骨髓ＭＳＣ的多分化潜能　多向分化潜能被认为是骨髓ＭＳＣ的最重要的生　物学特征。许多体外实验已证实骨髓ＭＳＣ可分化为　多种间充质组织，如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪　以及骨髓基质等。因此有人认为ＭＳＣ可能是保留于　成年组织器官中的胚胎干细胞或具有胚胎干细胞的　特性。而决定分化方向的关键就是诱导分化的条件。　（１）用含有１一甲基一３丁基一黄嘌岭、地塞米　松、胰岛素、消炎痛的培养基诱导骨髓ＭＳＣ分化，结　果分化的细胞内出现脂质空泡，并表达过氧化物酶增　多活性受体７２（ＰＰＡＲ７２）、脂多糖脂酶（ＬＰＬ）和脂肪　细胞的脂肪酸结合蛋白Ａｐ２，且其诱导分化率达　９５％。　（２）将骨髓ＭＳＣ经离心作用形成细胞团，并在　含有转化生长因子一口３的无血清培养基内培养，培　养过程中，细胞中富含蛋白多糖的细胞外基质逐渐增　多。Ｊｏｎｅ指出转化生长因子一口１在诱导分化过程是　十分必须的，它可以提供ＭＳＣ分化的未来信号【３ｊ。　Ｅｐｈｒａｔ以维生素ｃ、地塞米松、碱性成纤维细胞生长　因子在体外诱导骨髓ＭＳＣ，细胞密度大于１×１０６／　ｃｍ，培养诱导后软骨细胞的比例达到８５％　Ｊ。　（３）在含有地塞米松、８一磷酸甘油以及抗坏血　酸的１０％（ｖ／ｖ）牛胎血清培养基中，骨髓ＭＳＣ逐渐　形成骨结节，并且有大量碱性磷酸酶表达。定量检　测显示碱性磷酸酶的活性增加了４—１０倍。在整个　培养及诱导分化的过程中没有发现细胞的坏死或调　亡。同时，因为骨髓ＭＳＣ表面表达ＦＧＦ一１，２和　ＢＭＰ受体，对它们有较好的反应性，因此在有ＦＧＦ　及ＢＭＰ存在的作用下，诱导分化效果更好，且两者　作者单位：四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科（６１００４１）　

骨性材料复合绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞研究体系的建立与应用

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