最新整理大肠杆菌的检测(MPN计数法)教学提纲

大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。

本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。

一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。

在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。

1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。

缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。

2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。

该方法已被最可能数(MPN)法所替代。

3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。

在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。

三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。

一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。

2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。

例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。

3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。

大肠杆菌的检测(MPN计数法) 大肠杆菌的检测在环境和食品微生物检测中至关重要，因为这些微生物的存在可能指示污染和潜在的健康风险。

MPN计数法是一种常用的检测大肠杆菌的方法，下面将详细介绍这种方法。

一、MPN计数法简介MPN计数法，全称Most Probable Number，即最可能数，是一种通过统计学方法估算微生物数量的方法。

它的基本原理是在一定的稀释度下，通过系列梯度稀释的样本中存在微生物的概率来推算样本中实际的微生物数量。

二、MPN计数法检测大肠杆菌的步骤1.样品采集：采集被检样品，如水、食品等，并按照无菌操作的要求进行处理，以避免污染和交叉感染。

2.制备稀释液：将样品进行一系列的稀释，如10-1、10-2、10-3等。

每个稀释度的样品需要进行三份平行试验，以增加结果的可靠性。

3.选择合适稀释度的样品：根据实验结果，选择适合的稀释度的样品进行MPN计数。

这个稀释度应该是使样品中大肠杆菌的数量落在10~100之间，以提高估算的准确性。

4.培养：将选择的稀释度的样品分别接种到含有特殊培养基的试管中，培养基是为了促进大肠杆菌的生长。

每个试管中接种的样品量为10ml。

5.结果分析：经过一定时间的培养后，观察每个试管中的菌落数并记录。

根据统计学原理，通过这些数据可以得出样本中大肠杆菌的最可能数。

6.结果报告：根据实验数据，计算并报告每100ml（或者每1g）样品中大肠杆菌的最可能数。

三、MPN计数法的优势和局限性优势：1.MPN计数法是一种广泛应用的方法，可用于估计微生物的数量，不仅适用于大肠杆菌，还适用于其他微生物。

2.该方法不需要昂贵的仪器设备，操作相对简单，可用于基层实验室。

3.MPN计数法可以提供微生物数量的范围，而非单一数值，对于初步估计和趋势分析具有一定的参考价值。

局限性：1.MPN计数法的主观性较强，结果会受到操作人员的影响。

因此，需要操作者接受专业培训并遵循严格的操作规程。

2.MPN计数法的准确性相对较低，尤其是在微生物数量较少的情况下，可能存在较大的误差。

第一法大肠菌群MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。

6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。

6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。

6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。

6.2、初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST 肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。

记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。

未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。

6.3、复发酵试验用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。

食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测（MPN计数法）院系：食品科学与药学学院班级：食科114姓名: 张花学号: 114031431组长: 张军玲成员：张花赵晶郁朱娟娟大肠杆菌Petrifilm测试片计数法摘要食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段,而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一.根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌.其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。

Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。

该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。

关键词大肠杆菌Petrifilm测试法1设备和材料1。

1恒温培养箱:36±1℃。

1.2冰箱2～5℃。

1.3恒温水浴箱 :44。

5±0。

2℃。

1.4天平:感量0。

1g.1.5均质器1.6振荡器。

1.7无菌吸管：lmL（具0.01 mL刻度）、10mL（具0。

1mL刻度）或微量移液器及吸头。

1.8无菌锥形瓶：容量500mL。

1。

9 玻璃珠:直径约5mm。

1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸1。

11试管架.2. 培养基和试剂2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。

2.2EC肉汤.2。

3蛋白胨水.2。

4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP—VP实验用）。

2。

5磷酸盐缓冲液。

2。

6无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

2。

71mol/L氢氧化钠（NaOH ）：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。

2.81mol/L 盐酸（HCI ）：移取浓盐酸90ml,用蒸馏水稀释至1000ml。

3检验程序4.样品稀释4。

1固体和半固体样品：以无菌操作将检样25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内或其他稀释液的灭菌锥形瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。

食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌得检测(MPN计数法)院系: 食品科学与药学学院班级: 食科1１4姓名: 张花学号: 1140314３1组长: 张军玲成员: 张花赵晶郁朱娟娟大肠杆菌Petｒiｆilm测试片计数法摘要食品检测就是反映食品加工、贮藏、运输、等环节得卫生与安全状况得重要手段,而大肠菌群检测则就是食品检测得重要指标均之一。

根据定义大肠菌群就是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气得需氧与碱性厌氧得革兰氏阴性芽胞杆菌、其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌得可能性、Ｐｅtrifilｍ大肠菌群测试片就是由美国３M生产得一种预先制备好得ＶRＢ平板培养基系统,并添加了TTＣ作为菌落指示剂便于菌落判读,而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生得气体截留得作用、该方法目前已被多数权威机构认可,并在国内很多实验室开展运用、关键词大肠杆菌Petｒifilｍ测试法1设备与材料１。

１恒温培养箱:3６±1℃。

1。

２冰箱２～５℃、１。

３恒温水浴箱 :4４。

5±0、2℃。

1。

4天平:感量０。

１g。

1、5均质器1。

６振荡器。

1.７无菌吸管:ｌｍＬ(具０。

0１ mL刻度)、1０mＬ(具0、１mL刻度)或微量移液器及吸头。

1.8无菌锥形瓶:容量500ｍＬ。

1。

９玻璃珠:直径约5mm、１.10pH计或pH比色管或精密ｐH试纸1.１１试管架。

２。

培养基与试剂２.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨( LST )肉汤。

2、２ＥC肉汤。

2、3蛋白胨水。

2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水(MP-VP实验用)。

2。

5磷酸盐缓冲液。

2。

6无菌生理盐水:称取8。

５ｇ氯化钠溶于10０0ml蒸馏水中,121℃高压灭菌1５ｍｉn。

2、71ｍol／L氢氧化钠(NａOＨ ) :称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中、2.81moｌ/L 盐酸(HCI ) :移取浓盐酸９0ml,用蒸馏水稀释至100０ｍl。

3检验程序4.样品稀释4、1固体与半固体样品:以无菌操作将检样25mL样品,置盛有２25mL磷酸盐缓冲液得无菌均质杯内或其她稀释液得灭菌锥形瓶内(瓶内予置适当数量得玻璃珠,经充分振摇或研磨做成１:１0得均匀稀释液。

知识点：MPN法测定大肠杆菌群数情境：微生物检测技术任务：MPN法测定大肠杆菌群数课程：食品微生物技术MPN 法测定大肠菌群原理一、大肠菌群什么叫大肠菌群大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h内发酵乳糖并产酸产气。

二、MPNMPN❞食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。

❞据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以每mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。

三、MPN法测定原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。

待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

大肠菌群测定步骤1.液体样品稀释以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

2.梯度稀释❞用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取（1:10）样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，作成1:100的样品匀液。

❞根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1 mL灭菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

五、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。

教师姓名20 年月日星期授课班级
项目名称
《食品微生物技术实训项目教程》
项目八微生物检验技术实训任务2 大肠菌群检验
目的与要求1.掌握微生物检验流程
2.熟悉微生物检验的相关国标
3.掌握微生物检验的一般操作技术
课时 2
测定原理
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵产酸产气。

食品中大肠菌群数是以1mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。

据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以1mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。

仪器、试剂
生理盐水、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管、试管、小倒管、三角瓶等。

教学过程及时间安排1.实验内容讲解50min
2.取样及样品处理60min
3.样品稀释及接种培养初发酵（48h）40min
4.阳性计数及复发酵20min
5.查MPN表、讨论评分、实验整理10min
注意事项1.在进行样品稀释时，每做一个稀释度要换一支吸管；
2.接种时要先加入稀释液后再到培养基；
3.注意无菌操作；
4.正确查找MPN表。

结果分析依据国标查MPN值。

课后体会
教案。