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·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
非洲猪瘟病毒的基因特征谢春芳1,2，于瑞嵩1,2，董世娟1,2，陈冰清1,2(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程实验室，上海 201106)非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)唯一的成员，是双链DNA 大分子病毒，基因组长度介于170 kb ～193 kb，编码150～167个蛋白，其基因组从DNA 的两条链上读取，基因紧密间隔，病毒基因组末端由碱基不完全配对的发夹环共价闭合。
发夹环以两种形式存在，互补并相互反转，与终端相邻的是多种串联的反向重复序列。
大多数ASFV 毒株的基因组GC 含量*为38％，GC 含量相对较低的区域位于基因组两端的左可变区(Left Variable Region，LVR)和右可变区(Right Variable Region，RVR)，容易发生基因变异的多基因家族(Multigene Family，MGF)分布于LVR 和RVR [1-2]。
1 与复制和转录相关的基因细胞被ASFV 感染后，病毒DNA 开始在细胞核周围复制，F1055L 蛋白在复制的起始时结合DNA，并与DNA 起始酶融合。
病毒基因组编码病毒基因转录和复制所需的酶、参与DNA 碱基切除修复(Base Excision Repair，BER)途径的酶、逃逸免疫的酶、多基因家族蛋白(MGF360、MGF110、MGF100、MGF505)、功能性蛋白、结构蛋白和许多目前未知的蛋白。
ASFV 编码基因有150多个，ASFV 基因编码早期表达的蛋白主要包括与基因组复制相关的蛋白、后期转录因子及与免疫逃逸相关的MGFs 蛋白；ASFV 结构蛋白主要在感染后期表达[3-6]。
ASFV 的转录机制类似于真核RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNAP Ⅱ)系统，包括一个(8-亚基)ASFV RNAP 和TATA 结合蛋白(TATA Binding Protein，TBP)、转录起始因子Ⅱ B(Transcription Initiation Factor Ⅱ B，TF ⅡB)、延伸因子(Transcription Elongation Factor Ⅱ，TF Ⅱ)以及DNA 结合蛋白pA104R 和拓扑异构酶Ⅱ pP Ⅱ92R [3,7-9]。
现代生物科技专题——2021年高考生物真题模拟试题专项汇编【2021年山东卷，4】1.我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。
下列说法正确的是( )A.“引子”的彻底水解产物有两种B.设计“引子”的DNA序列信息只能来自核DNAC.设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列D.土壤沉积物中的古人类双链DNA可直接与“引子”结合从而被识别【2021年山东卷，5】2.利用农杆菌转化法，将含有基因修饰系统的T-DNA插入到水稻细胞M的某条染色体上，在该修饰系统的作用下，一个DNA分子单链上的一个C脱去氨基变为U，脱氨基过程在细胞M中只发生一次。
将细胞M培育成植株N。
下列说法错误的是( )A.N的每一个细胞中都含有T-DNAB.N自交，子一代中含T-DNA的植株占3/4C.M经n（n≥1）次有丝分裂后，脱氨基位点为A-U的细胞占1/2nD.M经3次有丝分裂后，含T-DNA且脱氨基位点为A-T的细胞占1/2【2021年山东卷，15】3.一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。
将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。
下列说法正确的是( )A.注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大B.单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合C.利用该小鼠只能制备出一种抗p72的单抗D.p72部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况【2021年6月浙江卷，20】4.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。
该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。
48 | 2020年第40卷第12期 总第287期 |非洲猪瘟流行特点及临床检测顾永远1，钱忠辉2，张华弟2，王瑞阳2，张春玲2*(1.上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海201403)非洲猪瘟(Africa Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa Swine Fever Virus，ASFV)引起的一种急性、出血性、烈性、高度接触性传染病，发病率高，死亡率高，可达100％，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，我国将该病列为一类动物疫病。
非洲猪瘟于1921年首次在非洲东部的肯尼亚地区暴发，之后在非洲大部分国家和地区流行。
在最初的几十年中，非洲猪瘟一直在非洲暴发，并未传播到其他洲。
直到1957年，非洲猪瘟在欧洲的葡萄牙被发现，之后开始在欧洲其他国家流行。
2007年，非洲猪瘟传入格鲁尼亚，很快侵入俄罗斯。
2018年8月，我国首例非洲猪瘟在辽宁省沈阳市暴发，之后在短短的一年时间内各个地区相继暴发，给养猪业带来了极大的经济损失，由此导致猪肉价格的持续上涨，严重破坏了市场交易秩序。
目前，中国养猪业进入后非洲猪瘟时代，清楚地了解非洲猪瘟的流行特点，认真严谨地做好临床检测对确保养猪生产正常进行至关重要。
1 非洲猪瘟病毒1.1 病毒的形态和结构ASFV 是一种单分子线状双链DNA 病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属唯一的成员，也是迄今发现的唯一的DNA 虫媒病毒。
ASFV 呈二十面体对称，在胞浆内复制，病毒直径为175 nm ～215 nm，病毒粒子由内到外依次为核质体、核衣壳、囊膜，囊膜又分为内层和外层。
国际病毒分类委员会在第六次报告中将ASFV 列入“类非洲猪瘟病毒属”，1998年正式将其列入非洲猪瘟病毒科，2005年最终将其列为非洲猪瘟病毒属。
ASFV 的DNA 核心位于病毒中间，二十面体衣壳与含类脂的囊膜形成病毒外周。
病毒粒子的结构蛋白有很多种，其中p72蛋白位于病毒衣壳的表面，是二十面体衣壳的重要组成部分，具有良好的反应原性和抗原性。
中国畜牧兽医 2022,49(7):2688-2697C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 基于非洲猪瘟病毒截短p 72蛋白的间接E L I S A 抗体检测方法的建立张文燕1,王亚文1,袁 晨1,冯亚文2,滕召剑1,商佳亮1,逯纪成3,宋勤叶1(1.河北农业大学动物医学院,河北省兽医生物技术创新中心,保定071000;2.河北省兽药监察所,石家庄050051;3.保定市动物疫病预防控制中心,保定071001)摘 要:ʌ目的ɔ建立非洲猪瘟病毒(A f r i c a ns w i n e f e v e r v i r u s ,A S F V )E L I S A 抗体检测方法㊂ʌ方法ɔ以重组截短p 72(p 72s )蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立E L I S A 的抗原㊁待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被㊁酶标板封闭㊁血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(r e c e i v e ro p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i c ,R O C )曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性㊁敏感性㊁批内与批间重复性;最后分别用建立的E L I S A 方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过W e s t e r n b l o t t i n g 验证E L I S A 的检测结果㊂ʌ结果ɔE L I S A 方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg /m L ,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1ʒ100和1ʒ5000;反应条件为:抗原于37ħ孵育1h 后经4ħ包被酶标板过夜㊁于37ħ封闭1h 或室温封闭2h ㊁待检血清和酶标抗体分别于37ħ反应60和45m i n 及加入底物后于室温避光显色20m i n;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D 450n m 值ȡ0.365时,判定为阳性;当D 450n m 值<0.365时,判定为阴性㊂该方法只与A S F V 阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒㊁伪狂犬病病毒㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到A S F V 抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153m g /m L ,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554m g /m L );批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%㊂对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)㊂进一步验证表明,W e s t e r nb l o t t i n g与E L I S A 的检测结果完全一致㊂ʌ结论ɔ建立了基于A S F V -p 72s 蛋白的E L I S A 抗体检测方法,该方法特异㊁敏感和重复性稳定,能够用于A S F 临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力㊂关键词:非洲猪瘟病毒(A S F V );截短p 72蛋白;原核表达;间接E L I S A 中图分类号:S 855.3文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.027 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-27基金项目:河北省重点研发计划项目 非洲猪瘟病原学和血清学快速检测技术的研究及应用 (21326613D );河北省高等学校科学技术研究青年项目 非洲猪瘟病毒p 72抗体检测E L I S A 方法的建立 (Q N 2022046)联系方式:张文燕,E -m a i l :z h a n g w e n y a n 1225@126.c o m ;王亚文,E -m a i l :w a n g yw 0323@163.c o m ㊂张文燕和王亚文对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者宋勤叶,E -m a i l :s o n g q i n ye @126.c o m E s t a b l i s h m e n t of I n d i r e c t E L I S A M e t h o d f o rD e t e c t i o no fA f r i c a nS w i n eF e v e rV i r u sA n t i b o d i e sB a s e d o nT r u n c a t e d p 72P r o t e i nZ HA N G W e n y a n 1,WA N G Y a w e n 1,Y U A N C h e n 1,F E N G Y a w e n 2,T E N GZ h a o ji a n 1,S H A N GJ i a l i a n g 1,L UJ i c h e n g 3,S O N G Q i n ye 1(1.V e t e r i n a r y B i o l o g i c a lT e c h n o l o g y I n n o v a t i o nC e n t e r of H e b e iP r o v i n c e ,C o l l eg e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e b e i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B a o d i n g 071000,C h i n a ;2.H e b e i P r o v i n c i a l I n s t i t u t e o f V e t e r i n a r y D r u g C o n t r o l ,S h i j i a z h u a n g 050051,C h i n a ;3.B a o d i n g A n i m a lD i s e a s eP r e v e n t i o na n dC o n t r o lC e n t e r ,B a o d i n g 071001,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i s s t u d y w a s a i m e d t o e s t a b l i s h a n E L I S A m e t h o d f o r d e t e c t i n g7期张文燕等:基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接E L I S A抗体检测方法的建立a n t ib o d i e sa g a i n s t A f r ic a ns w i n ef e v e rv i r u s(A S F V).ʌM e t h o dɔI nt h i ss t ud y,re c o m b i n a n t t r u n c a t e d p72(p72s)p r o t e i n w a s u s e d a st h e d e t e c t i o n a n t i g e n,a n dt h e o p t i m a l w o r k i n g c o n c e n t r a t i o nof a n t ig e n,s e r u mt ob ed e t e c t e da n de n z y m e-l a b e l e da n t i b o d y w e r ed e t e r m i n e db y s q u a r e t i t r a t i o n.Th e r e a c ti o n c o n d i t i o n s o f E L I S Aw e r e o p t i m i z e d,s u c h a s a n t i g e n c o a t i n g,E L I S A p l a t es e a l i n g,s e r u m/e n z y m e-l a b e l e d a n t i b o d y r e a c t i o n a n d s u b s t r a t e c o l o r d e v e l o p i n g.T h e t h r e s h o l de v a l u a t i o n c r i t e r i a o fr e c e i v e ro p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i c(R O C)c u r v e w e r e u s e dt o d e t e r m i n e t h en e g a t i v ea n d p o s i t i v ec r i t i c a l v a l u e so f t h em e t h o d.T h es p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n d i n t r a-a n d i n t e r-b a t c hr e p r o d u c i b i l i t y o f t h em e t h o dw e r ed e t e c t e d.F i n a l l y,at o t a l o f124s e r u m s a m p l e sw e r ed e t e c t e db y t h ee s t a b l i s h e dE L I S A m e t h o da n dc o m m e r c i a lk i t sr e s p e c t i v e l y.T h e p o s i t i v e d e t e c t i o nr a t e sw e r ec o m p a r e db y t h eE L I S Aa n dt h ek i t,a n dt h eE L I S Ar e s u l t sw e r e v e r i f i e db y W e s t e r nb l o t t i n g.ʌR e s u l tɔT h eo p t i m a l a n t i g e nc o a t i n g c o n c e n t r a t i o no fE L I S A w a s 0.5μg/m L,t h e b e s t d i l u t i o n r a t i o s o f s e r u ma n dH R P-c o nj u g a t e d a n t i b o d y w e r e1ʒ100a n d1ʒ5000, r e s p e c t i v e l y.T h e r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e a s f o l l o w s:T h e a n t i g e nw a s i n c u b a t e da t37ħf o r1h a n d t h e nc o a t e da t4ħo v e r n i g h t;T h eE L I S A p l a t ew a sb l o ck e da t37ħf o r1ho ra tr o o m t e m p e r a t u r e f o r2h;T h e r e a c t i o n t i m e o f s e r u mo r t h e e n z y m e-l a b e l e d a n t i b o d y w e r e a t37ħf o r 60o r45m i n,r e s p e c t i v e l y;An dt h es u b s t r a t ew a sk e p ta w a y f ro ml i g h t f o rc o l o rd e v e l op i n g a t r o o mt e m p e r a t u r e f o r20m i n.T h ed e t e r m i n a t i o nc r i t e r i ao fn e g a t i v ea n d p o s i t i v e s e r u m w e r ea s f o l l o w s:W h e nt h e D450n m v a l u eo ft h es e r u m t ob et e s t e d w a sȡ0.365,i tw a sd e t e r m i n e da s p o s i t i v e;W h e n t h a tw a s<0.365,i tw a s j u d g e da sn e g a t i v e.T h i sm e t h o do n l y s p e c i f i c a l l y b i n d s t o a n t i-A S F V p o s i t i v e s e r u m,b u t d i d n o t c r o s s r e a c tw i t h a n t i s e r u m s a g a i n s t C l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s,P s e u d o r a b i e s v i r u s a n dP o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s.T h em i n i m u m a m o u n t o f t o t a l p r o t e i n d e t e c t e d i nA S F Va n t i s e r u m w a s0.091t o0.153m g/m L,w h i c hw a s l o w e r t h a n t h a t o f c o m m e r c i a l k i t(0.110t o0.554m g/m L).T h em e a n c o e f f i c i e n t s o f v a r i a t i o n f o r i n t r a-b a t c h a n d i n t e r-b a t c h r e p e a t a b i l i t y t e s t sw e r e4.70%a n d5.125%,r e s p e c t i v e l y.T h e p o s i t i v e r a t e s o f s e r u ms a m p l e s d e t e c t e db y t h ee s t a b l i s h e d m e t h o d w e r e75.81%(94/124)a n dt h o s ed i db y c o m m e r c i a l k i tw e r e32.26%(40/124).F u r t h e r v e r i f i c a t i o n s h o w e d t h a t t h eE L I S Ar e s u l t sw e r e c o n s i s t e n tw i t ht h o s eo f W e s t e r nb l o t t i n g.ʌC o n c l u s i o nɔA nE L I S A a n t i b o d y d e t e c t i o n m e t h o d b a s e d o n A S F V-p72s p r o t e i n w a s e s t a b l i s h e d.T h i s m e t h o d w a s s p e c i f i c,s e n s i t i v e a n d r e p r o d u c i b l e.I tc o u l db eu s e df o rc l i n i c a ld i a g n o s i sa n de p i d e m i o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o no f A S F, w h i c hh a d g r e a t p o t e n t i a l f o r d e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n.K e y w o r d s:A f r i c a ns w i n ef e v e rv i r u s(A S F V);t r u n c a t e d p72p r o t e i n;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;i n d i r e c tE L I S A非洲猪瘟(A f r i c a ns w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A S F V)引起猪的一种急性㊁热性㊁高度接触性传染病,病死率高达100%,以体温升高㊁全身各组织和器官广泛性出血㊁脾脏异常肿大为主要特征[1-2]㊂世界动物卫生组织(O I E)将该病列为法定报告动物疫病之一,中国将其列为一类动物传染病㊂2018年8月3日,中国确诊首例A S F,随后该病在中国各个地区暴发和流行,给生猪养殖业造成了极大的经济损失[3-4]㊂2021年国内猪场出现基因突变或缺失的低毒力毒株[5-6]㊂该突变毒株感染猪的潜伏期和病程延长,感染猪排毒不规律,且排毒时间延长,致使A S F的防控难度加大㊂由于目前尚无预防和治疗A S F的有效疫苗和药物,故应用特异㊁敏感的病原和血清学检测技术,准确检测㊁排查和清除感染猪是控制本病的重要措施之一[4]㊂A S F V是目前已知的唯一D N A虫媒病毒,也是非洲猪瘟病毒科(A s f a r v i r i d a e)非洲猪瘟病毒属(A s f i v i r u s)的唯一成员㊂目前,已知的不同毒力的A S F V毒株分为8个血清群㊁24种基因型[7]㊂24种基因型在非洲均有流行,中国流行的主要为基因Ⅱ型,与格鲁吉亚毒株为同一个分支㊂2021年在河南和山东有流行基因Ⅰ型的报道[8]㊂A S F V基因组长9862中国畜牧兽医49卷170~193k b,包含151~167个开放阅读框(O R F s),编码150~200种蛋白质(68个结构蛋白和100多个非结构蛋白)[9-10]㊂这些蛋白与病毒的复制㊁结构形态㊁入侵感染及诱导宿主抗感染免疫等有关㊂p72是A S F V二十面体的主要组成部分,对病毒衣壳的形成起着重要作用㊂该蛋白由B646L 基因编码,大小为73.2k u,在病毒感染晚期表达,能诱导机体产生高效价的特异性抗体,并且在不同分离株之间高度保守,故p72是A S F V感染检测与诊断的重要靶标[10-11]㊂E L I S A是O I E推荐的A S F 临床血清学检测技术,国内虽然有基于p72蛋白的E L I S A抗体检测技术的研究报告[12-14],但目前尚缺乏理想的A S F V抗体检测试剂盒㊂故本研究以p72为靶标,建立了E L I S A抗体检测方法,旨在为A S F 的血清学检测与临床诊断提供重要技术支持㊂1材料与方法1.1菌株大肠杆菌R o s e t t a(D E3)感受态细胞,由河北农业大学传染病实验室保存㊂p E T28a-p72s表达菌种[12],由河北农业大学传染病实验室构建与保存㊂1.2材料和主要试剂A S F V抗体标准阳性㊁阴性猪血清以及临床采集的无疾病症状的猪的血清样本,由保定市动物疫病预防控制中心提供;H R P-羊抗猪I g G购自北京索莱宝生物技术有限公司;A S F V多抗原(p32㊁p62和p72)间接E L I S A试剂盒购自I D V E T公司;猪伪狂犬病病毒(P R V)㊁猪瘟病毒(C S F V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)抗血清均购自I D E X X公司;猪圆环病毒2型(P C V2)抗血清由河北农业大学传染病实验室制备与保存㊂1.3重组p72s的制备复苏p E T28a-p72s表达菌种,按照1ʒ100的比例接种到新鲜K a n a+/L B液体培养基中,37ħ下振摇培养至对数期(D600n m值达到约0.6~0.8)时,加入终浓度为0.5m m o l/L的I P T G,26ħ诱导培养5h;8000r/m i n离心7m i n收集菌体沉淀,于4ħ超声裂解菌体35m i n(超声2s㊁间歇2s㊁振幅30%);10000r/m i n离心15m i n后,分别取上清液和沉淀进行S D S-P A G E(分离胶浓度为12%,下同),检测蛋白的表达情况㊂进而用N i-A g a r o s eH i s 标签蛋白纯化试剂盒纯化p72s蛋白,经S D S-P A G E 检测蛋白的纯化结果㊂同时对蛋白进行W e s t e r n b l o t t i n g鉴定,即取p72s蛋白进行S D S-P A G E,然后将蛋白转印到醋酸纤维膜上;将膜置入5%脱脂奶粉的封闭液中,于4ħ下孵育过夜;洗膜,加入1ʒ200倍稀释的标准A S F V抗血清,室温孵育2h,同时设立标准A S F V阴性血清对照;洗膜,加入1ʒ4000稀释的H R P-羊抗猪I g G,室温孵育1.5h;洗膜,将膜置于D A B显色液中显色至条带清晰㊂1.4E L I S A方法的建立1.4.1抗原包被浓度与待检血清稀释倍数的确定采用方阵滴定法同时确定抗原包被浓度和待检血清稀释倍数㊂即将重组p72s稀释为0.5㊁1.0㊁2.0㊁4.0μg/m L,100μL/孔加入酶标板,每个浓度重复2孔;将酶标板置37ħ孵育1h,4ħ过夜;次日弃去包被液,用P B S T(含0.05%T w e e n-20的0.01m o L/LP B S,p H7.4)洗涤3次,3m i n/次;加入封闭液(含5%犊牛血清的P B S T)于37ħ封闭1h;分别将1ʒ50~1ʒ1600倍比稀释的阳性㊁阴性血清加入到不同浓度抗原包被的相应孔内,组成方阵,每孔100μL,于37ħ条件下反应1h;洗板3次(洗涤方法同前),每孔加入100μL H R P-羊抗猪I g G (1ʒ2500稀释),于37ħ反应45m i n;洗板,加入底物(T M B)显色液,100μL/孔,室温避光显色15m i n;每孔加入50μL2m o l/LH2S O4终止反应㊂在酶标检测仪上测定样本D450n m值,并计算阳性血清(P)与阴性血清(N)D450n m值的比值(P/N值),以确定抗原最佳包被浓度和待检血清的最佳稀释倍数㊂1.4.2封闭液与酶标抗体工作浓度的确定将4种封闭液(含5%犊牛血清㊁5%脱脂奶粉㊁1%明胶和2%B S A的P B S T)分别与1ʒ500㊁1ʒ1000㊁1ʒ2500㊁1ʒ5000倍比稀释的H R P-羊抗猪I g G 组成方阵,进行E L I S A,每个组合重复2孔㊂操作过程同1.4.1㊂根据P/N值的大小,确立最佳封闭液和酶标抗体的最佳稀释倍数㊂1.4.3反应条件的确定通过单一变量法优化E L I S A的反应条件,即将一定浓度的重组p72s加入到酶标板的相应孔内后,分别于37ħ孵育2h后4ħ过夜㊁37ħ孵育1h后4ħ过夜及4ħ过夜等条件下包被抗原,然后按照1.4.1所述的操作过程进行E L I S A,根据P/N值确定最佳抗原包被条件㊂随后依次对封闭条件(分别于37ħ和室温条件下封闭1和2h)㊁待检血清反应条件(37ħ或室温下反应30或60m i n)㊁酶标抗体反应条件(37ħ或室温下反应30㊁45或60m i n)及显色条件(室温避光显色10㊁15㊁20㊁25和30m i n)进行优化,确定E L I S A 的最佳反应条件㊂每个反应条件均重复1次㊂09627期张文燕等:基于非洲猪瘟病毒截短p 72蛋白的间接E L I S A 抗体检测方法的建立1.4.4 阴阳性临界值的确定 通过E L I S A 检测A S F V 抗体标准阳性血清和阴性血清各100份,每份血清重复1孔㊂用G r a p h P a dP r i s m 5.0软件绘制受试者工作特征(r e c e i v e ro p e r a t i n g ch a r a c t e r i s t i c ,R O C )曲线,计算判定特异抗体阴㊁阳性临界值,并应用S P S S 26.0数据统计分析软件对100份阴性血清D 450n m 值进行正态分布分析,评价阴阳性临界值划分的准确性㊂1.4.5 特异性试验 以建立的E L I S A 检测P R V -g E ㊁P R V -g B ㊁P C V 2㊁C S F V ㊁P R R S V 抗体阳性血清,同时设立A S F V 阳性对照与阴性对照,每份血清重复2孔㊂检验其他病毒抗体血清与p 72s 的交叉反应情况,评价建立方法的特异性㊂1.4.6 敏感性检测 分别用建立的E L I S A 和商品试剂盒检测5份(1#~5#)1ʒ100~1ʒ12800倍比稀释的A S F V 抗体标准阳性血清(每个稀释度重复2孔),分析建立方法与试剂盒检测的血清抗体效价㊂同时用分光光度计(N a n o D r o p 2000)测定所建立的E L I S A 方法和试剂盒可检测的血清中的最低蛋白含量㊂根据上述结果综合评价建立方法的检测灵敏度㊂1.4.7 重复性试验 用同一批次或3个批次的p72s 蛋白包被酶标板,检测9份临床血清样品,根据检测结果,分别计算E L I S A 的变异系数,评价E L I S A 的批内与批间重复性㊂1.5 初步应用、符合率检验及W e s t e r n b l o t t i n g 验证同时用建立的方法和试剂盒检测124份血清样本,比较两者检测结果的符合率㊂随机选择p 72s -E L I S A 与试剂盒检测均为阳性的血清5份,试剂盒检测为阴性而p 72s -E L I S A 检测为阳性的血清5份,以及p 72s -E L I S A 与试剂盒检测均为阴性的血清5份,进一步用W e s t e r nb l o t t i n g 验证㊂W e s t e r nb l o t t i n g 的主要步骤:将S D S -P A G E 后的p 72s 蛋白转印到P V D F 膜上,于4ħ下封闭过夜;洗膜,加入待检猪血清(1ʒ100稀释),室温孵育2h ;洗膜,加入H R P -羊抗猪I g G (1ʒ4000稀释),室温孵育1.5h ;洗膜,将膜置于D A B 显色液中于暗处显色,观察结果㊂2 结 果2.1 重组p 72s 蛋白的制备收集I P T G 诱导5h 后的p E T 28a -p 72s 表达菌,超声波裂解后进行S D S -P A G E 检测,可见以包涵体形式表达的目的蛋白条带,蛋白分子质量约42k u (图1A ),与预期大小相符㊂蛋白经镍柱纯化后,电泳无肉眼可见杂蛋白(图1B )㊂W e s t e r n b l o t t i n g 鉴定结果显示,重组p 72s 蛋白能够与标准A S F V 抗血清反应,在42k u 处显示目的条带,而与A S F V 抗体阴性血清不发生反应(图1C )㊂A ,重组p 72s 的表达及其表达形式:M ,蛋白质分子质量标准;1㊁2,分别为细菌诱导前与诱导后的产物;3㊁4,分别为菌体裂解后的上清液与沉淀㊂B ,重组p 72s 的纯化:M ,蛋白质分子质量标准;1,蛋白洗脱液;2~5,纯化蛋白样品㊂C ,重组p 72s 的W e s t e r nb l o t t i n g 鉴定:M ,蛋白质分子质量标准;1,重组p 72s 与A S F V 阳性血清反应;2,重组p 72s 与A S F V 阴性血清反应A ,E x p r e s s i o n a n d e x p r e s s i o n f o r mo f r e c o m b i n a n t p 72s :M ,P r o t e i nM a r k e r ;1a n d 2,P r o d u c t s o f p 72s e x pr e s s i o n b a c t e r i a b e f o r e a n da f t e ri n d u c t i o n ,r e s p e c t i v e l y ;3a n d 4,S u p e r n a t a n t a n d p r e c i p i t a t i o n a f t e r l y s i s o fi n d u c e d b a c t e r i a ,r e s p e c t i v e l y .B ,P u r i f i c a t i o no f t h e r e c o m b i n a n t p 72s :M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,P r o t e i ne l u t i o nb u f f e r ;2-5,P u r i f i e d p r o t e i ns a m pl e s .C ,W e s t e r n b l o t t i n g i d e n t i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n t p 72s :M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,R e a c t i o no fr e c o m b i n a n t p 72sw i t h A S F V -p o s i t i v es e r u m ;2,R e a c t i o no f r e c o m b i n a n t p 72sw i t hA S F V -n e ga t i v e s e r u m 图1 重组p 72s 蛋白的表达与纯化的S D S -P A G E 分析及W e s t e r nb l o t t i n g 鉴定F i g .1 A n a l y s i s o n e x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t p 72s p r o t e i nb y S D S -P AG Ea n d i d e n t i f i c a t i o nb y W e s t e r nb l o t t i n g1962中国畜牧兽医49卷2.2最佳抗原包被浓度和待检血清的稀释倍数当重组p72s以0.5~4.0μg/m L包被㊁待检血清1ʒ50~1ʒ100稀释时,阳性血清的D450n m值在1.108~2.612之间,阴性血清的D450n m值在0.166~ 0.366之间,此时的P/N值为5.363~8.448,高于其他组合的P/N值(表1)㊂但当血清1ʒ100稀释,蛋白包被浓度为4.0μg/m L时,阴性血清的D450n m 值高于0.5μg/m L包被时的D450n m值,故本试验确定E L I S A的最适抗原包被浓度为0.5μg/m L,待检血清的稀释度为1ʒ100㊂表1最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定(D450n m值)T a b l e1D e t e r m i n a t i o no f t h e o p t i m a l a n t i g e n c o a t i n g c o n c e n t r a t i o na n d t h e s e r u md i l u t i o n(D450n m v a l u e)血清稀释度S e r u md i l u t i o n项目I t e m s抗原包被浓度C o n c e n t r a t i o no f p72s/(μg/m L)0.51.02.04.01ʒ50P1.5851.6591.5032.612 N0.2280.2430.2380.366P/N6.9676.8256.3287.145 1ʒ100P1.2501.1911.1081.922 N0.1660.1960.2070.228P/N7.5536.0905.3638.448 1ʒ200P0.8620.8560.7681.325 N0.1590.1570.1660.239P/N5.4215.4664.6375.556 1ʒ400P0.7330.6310.5450.700 N0.1540.1500.1840.235P/N4.7724.2072.9622.983 1ʒ800P0.4220.4120.3660.613 N0.1450.1450.1600.178P/N2.9102.9602.2883.454 1ʒ1600P0.2800.2910.2720.402 N0.1450.1540.1660.194P/N1.9311.8901.6362.0782.3最佳封闭液和酶标抗体的稀释倍数由表2可知,以1%明胶和2%B S A作为封闭液时,阴性血清的D450n m值在0.188~1.242之间,特异性不好,故首先排除这两种封闭液㊂比较5%犊牛血清和5%脱脂奶粉作为封闭液时的P/N值时发现,后者的P/N值明显高于前者,且用5%脱脂奶粉作为封闭液㊁酶标抗体作1ʒ5000稀释时,阴性血清的D450n m值最低,且P/N值(15.019)较高㊂故确定E L I S A的封闭液为5%脱脂奶粉,酶标抗体稀释度为1ʒ5000㊂2.4最佳反应条件通过比较不同反应条件下的P/N值,发现当抗原包被酶标板后于37ħ孵育1h,再于4ħ吸附过夜,加入封闭液于37ħ封闭1h或者于室温下封闭2h,抗原与待检血清在37ħ反应60m i n,待检血清与酶标抗体在37ħ反应45m i n,底物于室温避光显色20m i n时,E L I S A的P/N值最大,分别为22.523㊁16.232或16.788㊁12.297㊁9.916和17.413,故确定上述条件为所建立的E L I S A(p72s-E L I S A)方法的最佳反应条件㊂2.5阴阳性临界值测定结果应用R O C曲线分析p72s-E L I S A检测的100份抗A S F V标准阳性和100份标准阴性血清的D450n m值,结果显示曲线下面积(A U C)为0.99929627期张文燕等:基于非洲猪瘟病毒截短p 72蛋白的间接E L I S A 抗体检测方法的建立(95%C I =0.9954~1.0000),以0.365为临界值,约登指数(0.99)最大,灵敏度为0.99(95%C I=0.9455~0.9997),特异性为1(95%C I =0.9638~1.0000),故当D 450n m 值ȡ0.365时,判定为阳性;当D 450n m 值<0.365时,判定为阴性(图2A )㊂进一步对上述100份阴性血清的D 450n m 值进行的正态分布分析,结果显示p 72s -E L I S A 偏度系数为0.156,峰度系数 0.487,均<1,单样本K -S 检验结果显示P =0.200(图2B )㊂表明p 72s -E L I S A 的检测结果服从正态分布㊂表2 最佳封闭液和酶标抗体稀释度的确定(D 450n m 值)T a b l e 2 D e t e r m i n a t i o no f t h e o p t i m a l b l o c k i n g b u f f e r a n dH R P -c o n j u g a t e da n t i b o d y d i l u t i o n (D 450n m v a l u e )酶标二抗稀释度H R P -c o n j u ga t e d a n t ib o d y d i l u t i o n 项目I t e m s 封闭液B l oc k i n g bu f f e r 5%犊牛血清5%c a l f s e r u m 5%脱脂奶粉5%s k i m m e dm i l k p o w d e r 1%明胶1%g e l a t i n2%B S A 1ʒ500P 3.8703.5393.8223.175N0.3980.2161.2400.515P /N 9.72216.3823.0826.1651ʒ1000P 3.5413.0333.5532.712N 0.3260.1361.2420.362P /N10.86022.3012.8607.4921ʒ2500P 2.5392.0062.6671.795N 0.2110.1000.7050.241P /N12.03120.0553.7837.4481ʒ5000P 1.6701.2021.6621.146N 0.1510.0800.3580.188P /N11.10615.0194.6416.096A ,临界值;B ,正态分布分析A ,C r i t i c a l v a l u e ;B ,N o r m a l d i s t r i b u t i o na n a l y s i s 图2 E L I S A 阴阳性临界值的确定F i g .2 D e t e r m i n a t i o no fE L I S An e ga t i v e a n d p o s i t i v e c r i t i c a l v a l u e 3962中 国 畜 牧 兽 医49卷2.6 特异性试验结果用p 72s -E L I S A 方法检测P R V -g E ㊁P R V -g B ㊁P C V 2㊁C S F V 和P R R S V 抗血清时,D 450n m 值均低于临界值(0.365)(图3),表明p 72s -E L I S A 方法具有良好的特异性㊂图3 p 72s -E L I S A 的特异性检测F i g .3 S p e c i f i c i t y de t e c t i o nof p 72s -E L I S A 2.7 敏感性检测结果用p 72s -E L I S A 和商品试剂盒同时检测5份A S F V 抗体标准阳性血清,结果p 72s -E L I S A 检测的血清抗体效价分别为1ʒ800㊁1ʒ1600㊁1ʒ800㊁1ʒ800和1ʒ800,试剂盒检测的抗体效价分别为:1ʒ200㊁1ʒ200㊁阴性㊁1ʒ800和1ʒ800(图4)㊂p72s -E L I S A 和试剂盒可检测到相应血清的总蛋白含量分别在0.091~0.153和0.110~0.554m g /m L 之间㊂上述结果表明,建立的p 72s -E L I S A 方法具有很高的敏感性㊂图4 p 72s -E L I S A (A )与商品试剂盒(B )的敏感性比较F i g .4 C o m p a r i s o no f s e n s i t i v i t y be t w e e n p 72s -E L I S A (A )a n d t h e c o m m e r c i a l E L I S Ak i t (B )2.8 重复性试验结果分别用同一批次和不同批次的p 72s -E L I S A 检测9份血清,结果如表3与表4所示,批内重复性试验的变异系数(C V )为0.736%~9.158%,批间重复性试验的变异系数为2.944%~8.205%,均低于10%㊂该结果表明,建立的E L I S A 方法均具有良好的重复性㊂49627期张文燕等:基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接E L I S A抗体检测方法的建立表3p72s-E L I S A批内重复性试验结果(D450n m值)T a b l e3p72s-E L I S Ai n t r a-b a t c h r e p e a t a b i l i t y t e s t r e s u l t s(D450n m v a l u e)血清编号S e r u mn u m b e r测定次数T i m e s o f t e s t s12345标准方差S D平均值M e a n变异系数C V/%11.5581.4181.5031.5261.4780.0531.4973.536 21.2021.1981.2031.2161.1920.0091.2020.736 31.2571.2831.2821.3221.2580.0261.2802.062 41.0891.0451.0611.0620.9990.0331.0513.157 50.5230.5640.5510.5510.5060.0240.5394.408 60.4160.3890.3830.4010.4110.0140.4003.509 70.1090.1250.1340.1170.1210.0090.1217.660 80.1150.1280.1450.1290.1420.0120.1329.158 90.2160.1790.2040.2100.1850.0160.1998.075表4p72s-E L I S A批间重复性试验结果(D450n m值)T a b l e4p72s-E L I S Ai n t e r-b a t c h r e p e a t a b i l i t y t e s t r e s u l t s(D450n m v a l u e)血清编号S e r u mn u m b e r蛋白批次P r o t e i nb a t c h123标准方差S D平均值M e a n变异系数C V/%13.2333.0613.0900.0923.1282.944 22.3852.2362.3860.0862.3363.696 32.1742.0182.1170.0792.1033.754 41.8201.7921.9020.0571.8383.110 50.8400.8270.8870.0320.8513.708 60.7170.6780.7520.0370.7165.173 70.1680.1430.1520.0130.1548.205 80.1790.1550.1730.0120.1697.391 90.1870.1600.1820.0140.1768.1462.9初步临床应用、符合率及验证分别用建立的p72s-E L I S A和商品试剂盒检测124份血清样本,结果如表5所示,p72s-E L I S A和商品试剂盒的A S F抗体阳性检出率分别为75.81% (94/124)和32.26%(40/124),A S F抗体阴性检出率分别为24.19%(30/124)和67.74%(84/124)㊂p72s-E L I S A与商品试剂盒的阳性符合率为100%,阴性符合率为35.71%,总符合率均为56.45%㊂进一步用W e s t e r nb l o t t i n g对p72s-E L I S A与试剂盒检测结果相符和不符的15份血清进行验证,结果显示,p72s-E L I S A与试剂盒检测结果同为阳性㊁试剂盒检测为阴性而E L I S A检测为阳性的血清, W e s t e r nb l o t t i n g检测均出现目的条带;试剂盒和E L I S A检测均为阴性的血清无目的条带出现(图5)㊂上述结果表明,p72s-E L I S A的检测结果与W e s t e r nb l o t t i n g检测结果完全一致,其A S F V抗体阳性检出率高于商品试剂盒㊂表5p72s-E L I S A与E L I S A试剂盒的符合率T a b l e5T h e c o i n c i d e n c e r a t e o f p72s-E L I S Aw i t hE L I S Ak i t项目I t e m s判定D e t e r m i n a t i o n试剂盒K i t阳性P o s i t i v e阴性N e g a t i v e总计T o t a lp72s-E L I S A阳性P o s i t i v e405494阴性N e g a t i v e03030总计T o t a l40841245962中 国 畜 牧 兽 医49卷M ,蛋白质分子质量标准;1~5,p 72s -E L I S A 与试剂盒检测均为抗体阳性的血清;6~10,p 72s -E L I S A 检测抗体阳性㊁试剂盒检测为抗体阴性的血清;11~15,p72s -E L I S A 与试剂盒检测均为阴性的血清;16,阳性对照;17,阴性对照M ,P r o t e i n M a r k e r ;1-5,P o r c i n e s e r aA S F V -a n t i b o d yp o s i t i v e d e t e c t e db yp 72s -E L I S Aa n d t h ek i t ;6-10,P o r c i n e s e r a A S F V -a n t i b o d yp o s i t i v eb yp 72s -E L I S A ,b u tn e g a t i v eb y t h ek i t ;11-15,P o r c i n es e r a A S F V -a n t i b o d y n e g a t i v eb yp 72s -E L I S Aa n d t h ek i t ;16,P o s i t i v e c o n t r o l ;17,N e g a t i v e c o n t r o l 图5 血清A S F V 抗体的W e s t e r nb l o t t i n g 分析F i g .5 W e s t e r nb l o t t i n g a n a l ys i s o fA S F Va n t i b o d i e s i n s e r u m 3 讨 论A S F 在全球的流行区域不断增加,快速检测和及时确诊感染猪或发病猪是有效控制该病的主要措施㊂已知随着A S F V 毒株的毒力㊁感染途径㊁感染剂量及宿主的抵抗力不同,A S F 的临床经过表现为最急性㊁急性㊁亚急性和慢性型等多种形式,致使该病的临床症状与病理变化复杂多样[1-2],尤其是A S F V 变异减毒株在中国猪场的出现,增加了非洲猪瘟流行的隐蔽性,同时给该病的临床诊断和防控带来了新的挑战[5-6]㊂应用P C R 检测唾液和血液样本中的病毒核酸是筛查A S F V 感染猪的重要手段[1-2],但由于A S F V 慢性和亚临床感染猪的排毒没有规律,仅仅依靠P C R 检测,常出现漏检现象,故需要结合抗体检测结果,以保证筛检的准确性[1-2]㊂鉴于此,不断改进和完善诊断与监测手段对于A S F 的有效防控至关重要㊂E L I S A 是广泛用于快速检测特异性抗体的常用检测技术,其不仅敏感性和特异性高,而且适于样本的批量检测和商品化㊂用于E L I S A 的检测抗原可以是完整的病原微生物,也可以是来自病原微生物或体外表达的蛋白㊂由于A S F 是中国规定的一类动物疫病,培养和纯化A S F V 需要生物安全防护3级(P 3)实验室,培养与纯化病毒成本高,并且在操作过程中存在散毒的安全隐患,而应用原核或真核表达系统表达的蛋白作为检测抗原,具有特异㊁敏感㊁成本低㊁安全等优势㊂因此,现在常通过体外表达手段,制备目标蛋白作为E L I S A 用抗原[13-16]㊂相对于真核表达系统,原核表达系统操作简单㊁成本低,所以本试验采用原核表达系统来表达p 72s 蛋白㊂E L I S A 结果的临界值确定直接关系到检测结果的准确性,临界值过高或过低会导致检测结果出现假阴性或假阳性㊂为了保证建立方法结果判定的客观性,本研究采用R O C 曲线分析方法确定阴阳性临界值,同时对已知阴性样本进行正态分布分析㊂已知进行R O C 曲线分析时,常用约登指数来评判方法的准确性,约登指数越大说明所建立方法的灵敏度越高㊁特异性越强[17-18]㊂本试验中约登指数的最大值为0.99,A U C 为0.999,并且样本检测结果服从正态分布,说明所建立方法同时具有很高的灵敏度㊁特异性与客观性㊂建立的p 72s -E L I S A 方法与常见的C S F V ㊁P R R S V ㊁P R V 等病毒无交叉反应,批内与批间重复试验的变异系数均低于10%,说明所建立的方法的特异性高㊁重复性好,这些特征与文献[13-15]报道的相似㊂但本研究不仅与商品试剂盒进行了比较,发现建立方法的敏感性和对血清样本的阳性检出率更高,而且为了确保检测结果的准确性,还应用W e s t e r nb l o t t i n g 对EL I S A 的结果进行验证,其结果与E L I S A 的检测结果完全一致,说明建立的E L I S A 方法具有更高的检测敏感性与准确性㊂4 结 论本研究建立了基于A S F V 截短p 72蛋白的间接E L I S A 抗体检测方法,该方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/m L ,待检血清的稀释度为1ʒ100;与P R V ㊁P C V 2㊁C S F V 和P R R S V 等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到A S F V 抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153m g /m L ,具有良好批内与批间重复性;对血清样本的阳性检出率高于商品试剂盒㊂建立的间接E L I S A 方法可以为A S F 的血清学调查㊁临床诊断及其综合防控提供重要技术支撑,具有显69627期张文燕等:基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接E L I S A抗体检测方法的建立著的应用开发潜力㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] SÁN C H E Z-V I Z C AÍN O J M,MU R L,G OM E Z-V I L L AMA N D O S J C,e t a l.A n u p d a t e o n t h ee p i d e m i o l o g y a n d p a t h o l o g y o fAf r i c a ns w i n ef e v e r[J].J o u r n a l o f C o m p a r a t i v eP a t h o l o g y,2015,152(1):9-21.[2] G A L L A R D O M C,R E O Y O A T,F E R N A N D E Z-P I N E R OJ,e t a l.A f r i c a n s w i n e f e v e r:A g l o b a l v i e wo ft h ec u r r e n tc h a l l e n g e[J].P o r c i n eH e a l t h M a n a g e m e n t,2015,1:21.[3] Z H O U X,L IN,L U O Y,e t a l.E m e r g e n c eo fA f r i c a ns w i n ef e v e ri n C h i n a,2018[J].T r a n s b o u n d a r y a n dE m e r g i n g D i s e a s e s,2018,65(6):1482-1484.[4] T E K L U ET,S U N Y,A B I D M,e ta l.C u r r e n ts t a t u sa n de v o l v i n g a p p r o a c h e st o 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生物寒假作业（六）——《选三》专项练习一、单选题1．为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。
下列叙述错误的是（）A．航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物B．细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀C．在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品D．采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征2．下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（）A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌3．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。
下列有关叙述错误．．的是（）A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法4．废水、废料经加工可变废为宝。
某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。
下列叙述正确的是（）A．该生产过程中，一定有气体生成B．微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料C．该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质D．沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理5．关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是（）A．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气B．白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程C．葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体D．生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌6．青霉菌的代谢类型为异养需氧型，其处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。
目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是A．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖B．可用深层通气液体发酵技术提高产量C．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中D．青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌7．植物体细胞通常被诱导为愈伤组织后才能表现全能性。
非洲猪瘟病毒的形态结构特征谢春芳1,2，于瑞嵩1,2，董世娟1,2，陈冰清1,2(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程实验室，上海 201106)非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是一种双链大DNA 病毒，目前是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)唯一的成员。
非洲猪瘟病毒粒子直径为250 nm ～ 300 nm，基因组长度为170 kb ～194 kb；细胞内ASFV 粒子直径约200 nm，病毒基因组与核蛋白聚集成病毒核心，核心外包裹有蛋白核壳，核壳外包裹着脂质内膜，脂质内膜外是二十面体蛋白衣壳，最后通过出胞获得病毒外膜，成为一个成熟完整的ASFV 粒子[1-5](图1)。
ASFV 在环境中非常稳定，在4 ℃血液中可保存一年以上，在肉制品中可保存数周。
ASFV 可在蜱类和猪中高效复制，并在两者之间循环传播[6]。
ASFV 通过脱壳侵入细胞，病毒脱壳需要酸性环境破坏病毒的外膜和蛋白衣壳。
在细胞的内泡小体内，病毒的外膜和二十面体蛋白衣壳被破坏，暴露出病毒内膜，病毒内膜与细胞膜融合，病毒核质得以进入细胞质内，感染宿主细胞。
ASFV 感染细胞后，在细胞质内质网附近的“病毒工厂(Viral Factories，VFs)”中进行复制[7]。
在早期核内复制阶段，ASFV 会导致细胞核膜破裂并募集细胞S 期特异性翻译因子——真核翻译起始因子4E/4G(eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G，eIF4E/4G)和真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1，4E-BP1)到病毒工厂，以增强病毒复制能力，然后在细胞质内进行病毒DNA 复制和包装[8-10]。
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2022,30(6):141-146·研究论文·非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及多克隆抗体的制备曹云雷1，高 飞1,2，李国新1,2，姜一峰1,2，郑 浩1,2，童 武1,2，黄 剑1,2，童光志1,2（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）摘 要：本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒（ASFV ）的B646L 基因。
获得其编码的p72重组蛋白，并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。
将ASFV B646L 全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体，构建原核重组表达质粒，经1 mmol/L IPTG 于16℃诱导16 h 后，利用SDS-P AGE 对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。
然后用纯化的p72重组蛋白为免疫原制备鼠源抗p72多克隆抗体，经过4次免疫后获得p72蛋白的多克隆抗体，随后采取血清来检测多克隆抗体。
结果显示，利用p72蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步对ASFV B646L 基因建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；B646L 基因；p72蛋白；多克隆抗体中图分类号：S852.651文献标志码： A文章编号：1674-6422（2022）06-0141-06Prokaryotic Expression of African Swine Fever P72 Protein and Preparation ofPolyclonal AntibodiesCAO Yunlei 1, GAO Fei 1,2, LI Guoxin 1,2, JIANG Yifeng 1,2, ZHENG Hao 1,2, TONG Wu 1,2,HUANG Jian 1,2, TONG Guangzhi 1,2(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention andControl of Important Animal Infectious Disease and Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2020-05-14基金项目：国家自然科学基金ASFV 专项（31941017）；广东省重点领域研发计划项目（2019B020211003）；广东省畜禽疫病防治研究重点实验室开发基金项目（YDWS1906）作者简介：曹云雷，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：童光志，E-mail：***************.cn Abstract: The objective of the present study was to express the African swine fever virus (ASFV) B646L gene through a prokaryotic expression system, obtain its encoded p72 recombinant protein and prepare polyclonal antibodies. The full-length gene of ASFV B646L was ligated into pCold-I expression vector to construct prokaryotic recombinant expression plasmid. After induction at 16℃ for 16 h with 1 mmol/L IPTG, the recombinant p72 protein was examined for its expression and reactivity in SDS-PAGE and Western blot. Then the purifi ed p72 recombinant protein was used to immunize mice four times to prepare polyclonal antibodies. The results show that polyclonal antibodies against p72 protein had high titers and good specifi city, which laid a foundation for further study on the biological function of ASFV B646L gene and establishment of rapid and specific serological diagnosis.Key words: African swine fever virus; B646L gene; p72 protein; polyclonal antibody· 142 ·中国动物传染病学报2022年12月非洲猪瘟（african swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引发的一种急性、热性的猪流行症[1]。
五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编97-生物技术工程-细胞工程-动物细胞融合与单克隆抗体的制备（含解析）一、单选题1．（2022·山东·高考真题）如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。
下列说法错误的是（）A．双抗可同时与2种抗原结合B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞2．（2021·山东·统考高考真题）一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。
将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72 注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72 的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。
下列说法正确的是（）A．注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大B．单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合C．利用该小鼠只能制备出一种抗p72 的单抗D．p72 部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况3．（2021·江苏·高考真题）下列关于哺乳动物胚胎工程和细胞工程的叙述，错误的是（）A．细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等物质B．早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体C．猴的核移植细胞通过胚胎工程已成功地培育出了克隆猴D．将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞4．（2020·浙江·高考真题）下列关于病毒的叙述，错误的是（）A．有的病毒经灭活处理后，可用于细胞工程中介导动物细胞的融合B．适当增加机体内参与免疫的细胞数量与活性，可提高对新型冠状病毒的抵御能力C．在某人的分泌物中检测到新型冠状病毒，推测该病毒的增殖不依赖于宿主细胞D．用高温高压处理病毒使其失去感染能力，原因之一是病毒的蛋白质发生了热变性5．（2020·北京·统考高考真题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。
上海农业科技谢春芳，等：非洲猪瘟生物学特性及防控措施2020(5):72-75•养殖业•非洲猪瘟生物学特性及防控措施谢春芳李震"(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海市闵行区201106)摘要：非洲猪瘟是目前全球养殖业及公共卫生部门面临的广泛性传播的动物性疾病，其流行和爆发不仅给养猪业造成了毁灭性的损失，也给猪肉食品安全带来了巨大威胁，给人类的健康安全埋下了巨大的安全隐患。
非洲猪瘟病毒分子量大且容易变异，病毒结构较为复杂，可在自然环境中长期存在，这给非洲猪瘟的预防控制带来了难度。
现就非洲猪瘟生物学特性的国内外研究近况进行综述，包括传播、病毒结构特征和分型、对人的危害、感染猪的临床症状、诊断以及防控措施等，以期更好地防控非洲猪瘟。
关键词：非洲猪瘟；生物学特性；复杂性；多变性；免疫防控中图分类号：S85非洲猪瘟(African swine fever,ASF)于1921年在肯尼亚首次报道，最初称之为“东非猪瘟”(East African Swine Fever),1935—1939年在南非发生大规模流行，1957年在撒哈拉以南的大部分国家流行，然后通过葡萄牙传到欧洲及周边国家“3,, 2007年在格鲁吉亚、亚美尼亚、俄罗斯、伊朗、乌克兰、白俄罗斯、波罗的海国家、波兰、捷克、罗马尼亚、马尔代夫、拉脱维亚和匈牙利传播流行⑷，2018年我国辽宁省首次发现非洲猪瘟感染猪，其后，蒙古、越南等亚洲国家报道有非洲猪瘟发生卜叫非洲猪瘟在全球范围迅速传播蔓延，不仅给养猪业造成毁灭性的损失，也给猪肉食品安全带来巨大威胁。
非洲猪瘟病毒在被感染细胞内能产生100多种蛋白切,这些病毒蛋白大量存在于感染非洲猪瘟的病猪体内,会给人类的健康带来巨大的安全隐患。
为更好地防控非洲猪瘟，笔者拟对非洲猪瘟生物学特性的国内外研究近况进行综述，以供参考。
1非洲猪瘟的传播非洲猪瘟病毒只感染猪，家猪、野猪和软婢是非洲猪瘟病毒的主要宿主(非洲猪瘟病毒可在婢体内存活数年且保持病毒感染活性)。
