木薯淀粉发酵生产L_乳酸的培养条件优化

2009 年第 7 期
总第 208 期 ·35·
由图 3 可知，当 MgSO4·7H2O 和 MnSO4 浓度分别为 0.4%、0.01%时，L-乳酸产量达到最大值；而浓度分别大于 0.4%、0.01%时，L-乳酸产量开始下降。分析其原因，应该 是 Mg2+和 Mn2+在低浓度时，可以激活代谢途径中某些关键 酶的活性，对细胞生长和产物合成有促进作用，而在高浓 度时则有抑制作用。 2.4 不同接种量对木薯淀粉发酵L-乳酸的影响
Optimization of fermentation conditions in producing L-lactic acid by cassava starch
SUN Liang, SUN Feifei, HUANG Yanyan, LU Fuzhi, HUANG Ribo*
(Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530003, China)
由图 4 可以看出，接种量为 6%、8%时，L-乳酸浓度 较高，而 10%的接种量对应的乳酸浓度反而最低，究其原 因，应该是接种量过大，使得前期生长过快、培养液黏度增 加，菌体早衰，造成发酵后劲不足，影响产酸量及转化率。 因此，选择 6%的接种量用于木薯淀粉发酵 L-乳酸。 2.5 不同CaCO3对木薯淀粉发酵L-乳酸的影响
编码
X1 X2 X13 X4 X5 X6 X7 X8 X9
变量
酵母粉 MgSO4·7H2O
MnSO4 Tween-80
K2HPO4 乙酸钠 柠檬酸二铵 CaCO3 接种量
水平 ／％
-1
+1
0
2
0
0.4
0
0.01
0
0.1
0
0.25

0.5
0
0.2
7
8
6
8
2.2 不同氮源对木薯淀粉发酵L-乳酸的影响 在乳酸菌发酵生产L-乳酸过程中，氮源是影响生产
乳酸是一种重要的多用途有机酸，目前已被广泛应用 于食品、制药、饲料、医药、农药、日用化工、皮革和纺织等 行业。近年来最主要的用途是开发了以 L-乳酸为原料，具 有生物相容性、可生物降解的新型环保材料聚乳酸 （PLA）。目前国内外大多数以发酵法生产 L-乳酸的工艺 研究主要集中在玉米、大米、马铃薯等粮食作物上，而对非 粮作物———木薯淀粉发酵生产 L-乳酸的研究鲜有报道。
采用较大的接种量可缩短生长达到高峰的时间，使产 物的合成提前。但是，如接种量过大，也可能使菌种生长过 快、培养液黏度增加，营养物质消耗过快，菌体早衰，造成 发酵后劲不足，影响产酸量及转化率。如果接种量过少，菌 体增长缓慢，会延长发酵周期，不利于菌株高产。因此，选 择接种量为 4%~10%进行发酵试验，结果见图 4。
China Brewing
Research Report
试验设计表中每一竖行的高、低水平试验次数相等。总的 试验次数为 k+1，其中 k 为变量数。
根据单因素试验及参考了相关文献[5-7]后，选出影 响木薯淀粉发酵 L-乳酸的 9 个因素，对这 9 个因素选用 N =12 的 PB 设计，并余留 2 个空项做误差分析，试验设计 见表 1。
本研究通过单因素试验方法和 Plackett-Burman 试验 方法，对木薯淀粉发酵生产 L-乳酸的培养条件及培养基主 要因子进行了优化和筛选，通过对试验进行统计学设计和数 据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素。为进一步采 用木薯淀粉发酵 L-乳酸的工业化生产提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 菌种 鼠李糖乳杆菌 1553 （Lactobacillus rhamnosus，JCM
由图 1 可以看出，该菌种在培养 4h 左右开始进入对 数生长期，之后菌体数量迅速增加；14h 后，菌体数量趋于 稳定，即进入稳定期；可见该菌株的对数生长期应该在 4h~14h。在 L-乳酸发酵中选择适当的种龄非常重要，过老 或太年轻的种子都会对发酵产生不利影响。一般选择种 龄在菌体处于分裂旺盛的对数生长中后期的菌种为宜。 此时的种子繁殖能力强，浓度高接入发酵培养基后能很 快进入对数生长，有利于缩短发酵周期和提高产酸率。太 年轻的种子接种后使菌种前期的生长缓慢，发酵周期延
1553）：购于日本。 1.2 培养基
MRS 培养基：葡萄糖 2%，酵母粉 0.5%，蛋白胨 1%， 牛肉膏 1%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO4 5.6mg/L，乙酸钠 0.5%，柠檬酸二铵 0.2%。
发酵培养基：木薯淀粉 24%，酵母粉 2%，CaCO3 8%。 1.3 方法 1.3.1 试验设计
酸的影响 微 生 物 在 生 长 发 酵 过 程 中 ，需 要 磷 、镁 、硫 、铁 、钾 、 钠、氯、锌、锰等元素作为酶的激活剂、生理活性物质的组 成或生理活性作用的调节剂。 分别采用 0%~0.5%的 MgSO4·7H2O 浓度和 0%~0.1%
研究报告
中国酿造
的 MnSO4 浓度加入发酵培养基，37℃培养，来研究不同 MgSO4·7H2O、MnSO4 浓度对木薯淀粉发酵 L-乳酸的影 响，结果见图 3。
在 L-乳酸发酵中，随着发酵进行不断产酸，pH 值也
随之下降，一般在 pH 值< 5 时发酵即被抑制。因此 L-乳 酸发酵过程中一般通过添加中和剂(NaOH、氨水、CaCO3 ) 来调节 pH 值进行发酵[11]。本试验选择 CaCO3 作为中和剂， 设定 CaCO3 浓度为 5%~11%，培养 48h 后，分别测定 L-乳 酸产量，结果（图 4）可以看出，CaCO3 浓度为 5%~6%时， L-乳酸产量较低；CaCO3 浓度为 7%、~11%时，L-乳酸产 量较高。其中 11%对应的 L-乳酸产量最高。但随着 CaCO3
长，产酸低。过老的种子虽然菌体量较多，但会出现菌体 过早衰退的现象，最终导致产酸能力下降。因此，选择 12h 作为该菌种接入发酵培养基中的种龄。
表1 因素编码表 Table1.Media components and test levels for Plackett–Burman
experimental design
单因素试验：以木薯淀粉为唯一碳源，通过设计一系 列 的 单 因 素 试 验 ， 研 究 不 同 氮 源 、MgSO4·7H2O 浓 度 、 MnSO4 浓度、pH 值、温度、CaCO3 浓度、接种量对木薯淀粉 发酵生产 L-乳酸的影响。
Plackett-Burman试验：Plackett-Burman 设计是一种可 以从众多种考察因素中用最少的试验次数快速有效地评 价各因素之间相对重要性的试验设计方法，适用于从众多 的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。同 时，它也是一种 2 水平的试验设计方法，每一变量设置 2 个不同的水平，高水平和低水平，分别用(+)和(-)来代表。
Abstract: By single factor experiments and Plackett-Burman design, the ferm entation conditions and key factors in medium for L-lactic acid production by cassava starch were optimized and screened. The results showed that the age of Lactobacillus rhamnosus used in fermentation of L-lactic acid by cassava starch was 12h; the medium contained yeast extract as nitrogen source, 0.4% MgSO4·7H2O, 0.01% MnSO4 and 7% CaCO3; the inoculum was 6%; the optimum temperature and pH for lactic acid production were 37℃ and 6.3, respectively. By Plackett-Burman test, the yeast extract, K2HPO4 and MgSO4·7H2O which would affect L-lcatic acid production significantly were selected as key factors. The linear regression equation with L-lactic acid as response value was obtained. Key words: L-lactic acid; cassava starch; Plackett-Burman design
乳酸钙含量：WCaL2=218.2 c×V(mg) L-乳酸含量：WLa=180 c×V(g/L)
式中：V 表示滴定消耗Na2 EDTA 的量，mL；c 表示 Na2 EDTA 的浓 度，mol/L。
2 结果与讨论 2.1 种龄的确定
将活化后的菌种按 6%接种于发酵培养基中，37℃培 养，每隔 2h 取样，测定菌体密度 OD600。以培养时间为横坐 标，OD 值为纵坐标绘制菌体生长曲线见图 1。
研究报告
中国酿造
2009 年第 7 期
总第 208 期 ·33·
木薯淀粉发酵生产L-乳酸的培养条件优化
孙 靓，孙菲菲，黄艳燕，卢福芝，黄日波*
（广西科学院，广西 南宁 530003）
摘 要：通过单因素实验方法和Plackett-Burman实验方法，对木薯淀粉发酵生产L-乳酸的培养条件及培养基主要因子进行了 优化和筛选。实验结果表明：鼠李糖乳杆菌发酵木薯淀粉生产L-乳酸的种龄为12h，培养基氮源为酵母粉，MgSO4·7H2O含量 为0.4%，MnSO4含量为0.01%，CaCO3含量为7%，接种量为6%；木薯淀粉发酵乳酸的最适温度为37℃，最适pH值为6.3；通过 Plackett-Burman实验，从酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、接种量、Tween-80、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸二铵等9个因素中筛 选出了对L-乳酸产量具有明显影响的因素为：酵母粉、K2HPO4和MgSO·4 7H2O，并得到了L-乳酸产量为响应值的线性回归方程。 关 键 词：L-乳酸；木薯淀粉；Plackett-Burman设计 中图分类号:TQ921 文献标识码: A 文章编号：0254-5071(2009)07-0033-05