实验七 细胞骨架观察

细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架细胞骨架的免疫荧光标记及定位观察免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。

它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记并获得成功。

根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。

荧光素在一定条件下可与抗体分子结合同时不影响抗体免疫活性的特性。

用荧光抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原与标记抗体特异性结合，形成的免疫复合物固定于细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的可见物体，从而可以对抗原或抗体的性质进行定性、定量和定位分析。

常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。

免疫荧光的应用范围极其广泛，可以用于内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质的研究。

免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。

主要缺点是：存在非特异性染色，结果判定的客观性不足，步骤比较复杂。

免疫荧光分为直接法、间接法和补体结合法。

直接法：将荧光素直接偶联在一抗上，不需要二抗。

1.检查抗原法：这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。

此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。

2.检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。

间接法:先用未标记的特异抗体（一抗）与抗原结合，再用有荧光素标记的抗抗体（二抗，如抗IgG的抗体）与标本反应，样品中若有与一抗结合的抗原存在，则会形成抗原-抗体-抗抗体复合物从而达到染色的目的。

实验细胞⾻架的显⽰及观察实验4 细胞⾻架的显⽰及观察姓名：李思露学号：131140040⼀、实验⽬的1.掌握⽤考马斯亮蓝R250染⾊观察动物和植物细胞⾻架的原理和⽅法。

2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和⽅法。

⼆、实验原理1.细胞⾻架：指真核细胞中的蛋⽩纤维⽹架体系。

⼴义的细胞⾻架包括细胞核⾻架、细胞质⾻架、细胞膜⾻架和细胞外基质。

狭义的细胞⾻架是指细胞质⾻架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated filament，IF）。

2.微管微管是细胞内由微管蛋⽩形成的直径约呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。

微管蛋⽩有α和β两种。

αβ异⼆聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。

微管不稳定，对低温（冷冻）、⾼压等物理因素及秋⽔仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。

紫杉醇可以和微管蛋⽩多聚体结合，抑制微管解聚。

3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋⽩（actin）组成的直径为5～7nm的⾻架纤丝。

主要分布在细胞质膜的内侧，作⽤是确定细胞表⾯特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。

脊椎动物肌动蛋⽩分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋⽩组成不同。

肌动蛋⽩单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋⽩链互相缠绕扭曲成⼀股微丝。

细胞松弛素B为微丝断裂剂。

4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋⽩组成的细胞⾻架（1）了解细胞⾻架与细胞各种功能⾏使之间的关系。

（2）了解理化因素是否通过影响细胞⾻架对细胞功能产⽣影响，以便趋利避害。

（3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。

6. 显⽰细胞⾻架的常⽤⽅法：考马⽒亮蓝染⾊法、免疫荧光染⾊法、⿁笔环肽标记法。

（1）考马斯亮蓝染⾊法原理及特点原理：⽤去垢剂Triton X-100处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与⼤部分⾮⾻架蛋⽩疏⽔区结合⽽将其溶解，剩下的纤维状细胞⾻架蛋⽩⽐较稳定⽽不被溶解，然后⽤蛋⽩染料考马斯亮蓝染⾊即可显⽰其结构。

第1篇一、实验目的1. 理解细胞骨架的基本概念及其在细胞生物学中的重要性。

2. 掌握使用荧光显微镜观察细胞骨架的方法和技巧。

3. 认识细胞骨架的主要组成成分，包括微丝、微管和中间纤维。

4. 分析细胞骨架在不同细胞类型和生理状态下的形态和分布。

二、实验原理细胞骨架是真核细胞内由微丝、微管和中间纤维组成的网状结构，负责维持细胞形态、细胞运动、物质运输、信号传导等重要功能。

微丝主要由肌动蛋白组成，微管主要由α-和β-微管蛋白组成，而中间纤维则由多种蛋白质组成。

细胞骨架的结构和动态变化对细胞的正常生理功能至关重要。

三、实验材料与仪器材料：1. 植物细胞样本（如洋葱鳞片叶表皮细胞）2. 动物细胞样本（如小鼠成纤维细胞）3. 荧光标记的细胞骨架蛋白抗体4. 抗荧光标记的抗体5. 胶体金标记的抗体6. 封片剂仪器：1. 荧光显微镜2. 激光共聚焦显微镜3. 冷冻切片机4. 液氮5. 恒温培养箱6. 电子显微镜四、实验步骤1. 样本制备：- 植物细胞样本：取洋葱鳞片叶表皮细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。

- 动物细胞样本：培养小鼠成纤维细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。

2. 荧光标记：- 将切片置于含有荧光标记的细胞骨架蛋白抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

3. 抗荧光标记抗体：- 将切片置于含有抗荧光标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

4. 胶体金标记抗体：- 将切片置于含有胶体金标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。

- 洗涤切片，去除未结合的抗体。

5. 封片：- 将切片置于封片剂中，覆盖玻片，封片。

6. 显微镜观察：- 使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的形态和分布。

五、实验结果与分析1. 洋葱鳞片叶表皮细胞：- 在荧光显微镜下观察到洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架主要由微丝和微管组成。

- 微丝呈网状分布，主要位于细胞质膜内侧。

- 微管呈束状分布，主要位于细胞核周围。

细胞骨架实验报告分析
实验目的：分析细胞骨架的结构和功能。

实验方案：
1. 从培养皿中取出细胞样本。

2. 用PBS缓冲液洗涤样本，去除杂质。

3. 采用适当的方法对细胞样本进行固定，如使用甲醛或冷冻固定法。

4. 进行细胞透明化处理，如使用醋酸正己酯或醋酸乙腈进行处理。

5. 使用荧光染料标记细胞骨架，如荧光标记的抗体。

6. 进行显微观察，使用显微镜观察细胞骨架的形态和结构，并记录观察结果。

7. 分析细胞骨架的组成和功能。

实验结果：
观察细胞骨架后，我们发现细胞骨架主要由微观结构组成，包括微丝、微管和中间丝。

微观结构在细胞内起着维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂等重要功能。

微丝由细胞骨架蛋白聚合体组成，主要存在于细胞质中。

微丝的直径约为7纳米，长度可变。

微丝在细胞运动、肌肉收缩等方面起到重要作用。

微管由微管蛋白聚合物组成，是一种管状结构。

微管的直径约为25纳米。

微管在细胞分裂、细胞内物质运输等过程中起到
重要作用。

中间丝是由中间丝蛋白聚合物组成的，直径约为10纳米。

中间丝在细胞内提供机械支持，使细胞具有较强的抗压性。

实验结论：
细胞骨架是细胞内的重要组成部分，对维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂等过程起着重要作用。

细胞骨架的主要组成包括微丝、微管和中间丝，它们通过不同的机制实现细胞的各种功能。

对于进一步研究细胞活动、细胞生物学和生物医学领域的研究具有重要意义。

细胞骨架观察实验设计I、实验内容一、正常细胞二、秋水仙素处理三、VP16处理四、低温处理II、实验流程一、细胞传代二、细胞爬片1~2d三、细胞处理6h四、细胞固定、免染、观察1dIII、实验过程一、细胞传代1、实验材料VEC2、实验器材超净台、CO2培养箱、普通冰箱、倒置显微镜、离心机、离心管、微量加液器、吸管、细胞培养瓶（皿）、镊子、酒精灯、消毒酒精、废液缸3、试剂胰酶、PBS、培养液（牛血清、双抗）二、细胞爬片已处理盖片三、细胞处理细胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱四、细胞固定、免染、观察1、实验材料已处理的爬片2、实验器材离心机、离心管、玻璃培养皿、载玻片、滤纸、封口膜、温箱、荧光显微镜、微量加液器、镊子3、试剂PBS、BSA封闭液、一抗、二抗、蒸馏水、DAPI4、步骤固定爬片置于玻璃培养皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min吸弃PBS，加-20℃预冷甲醇，固定5min吸弃甲醇，PBS洗3次，每次2min免染吸弃PBS，加100uL 2﹪BSA封闭液，盖上培养皿盖，室温固定15min滤纸吸去片子上封闭液，加30uL （1:500）稀释一抗，盖上封口膜（勿大于盖片），37℃孵育30min ,边上滴一滴PBSPBS洗3次，每次5min在边缘吸弃PBS（滤纸），滴加30uL（1:200）稀释二抗，避光，盖封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min吸弃PBS，蒸馏水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干干净载玻片上，滴加3uLDAPI，将爬片镊子夹上，反盖于防淬灭剂上荧光镜观察IV、注意事项1、区分盖片正反面2、保持样品湿润3、一抗二抗孵育后，封口膜轻轻冲起4、二抗孵育后，避光操作，以免荧光淬灭5、标本染色后立即观察，不看时4℃保存。

细胞骨架和细胞核荧光观察实验报告一、摘要细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分，以及与细胞运动有关的结构，它包括微管、中间纤维、微丝。

当用适当浓度的Triton X-100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。

二、实验目的观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。

三、实验原理(1)考马斯亮蓝染色法原理及特点原理:用去垢剂.Triton X-100处理细胞适宜时间,可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。

特点:非特异蛋白染色，不能区分微管、微丝。

(2)鬼笔环肽标记法原理及特点原理:鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白，因此，用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。

特点:灵敏，能特异显示微丝。

三、实验用品(一)器材：荧光显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。

(二)试剂：Alexa Fluor TM 488 Phalloidin（微丝特异性药物）、Hoechst 33342（细胞核显色试剂）、4%多聚甲醛（固定）、PEM 缓冲液、 0.5% Triton X-100(三)材料：植物细胞/动物盖片单层培养细胞四、实验方法(一)细胞爬片：细胞盖片单层培养(二)细胞固定：①37℃预温PEM洗3次②37℃预温4%多聚甲醛固定15 min③37℃预温PEM洗3次(三)细胞通透：①37℃预温0.5% Triton X-100通透处理约10 min ②37℃预温PEM洗3次(四)微丝及细胞和染色：①120 nmol/L Alexa Fluor TM 488 Phalloidin10 μl湿盒中室温染色30 min②37C预温PEM避光洗3次③避光滴加10 μl. Ho.33342复染色(五)荧光观察：①制作临时装片②荧光显微镜观察五、实验结果：在荧光显微镜下可特异的显示出微丝。