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免疫血清的制备实验报告
《免疫血清的制备实验报告》
实验目的：
本实验旨在通过免疫反应制备免疫血清，以便用于后续的免疫学研究和临床诊断。
实验材料和方法：
1. 实验动物：选择适合的实验动物，如小鼠或兔子，进行免疫原注射。
2. 免疫原制备：根据研究需要选择合适的抗原，并进行纯化和浓缩处理。
3. 免疫程序：将免疫原与适宜的佐剂混合，然后注射到实验动物体内，以激发免疫反应。
4. 血清采集：在免疫原注射后，定期采集实验动物的血清样本，以监测抗体水平。
5. 血清制备：通过离心和沉淀的方法，从血清中分离出免疫球蛋白，得到免疫血清。
实验结果：
经过一系列的免疫程序和血清采集，成功制备得到了免疫血清。
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）等方法，验证了免疫血清中存在特定的抗体，具有对应的特异性和亲和力。
实验结论：
本实验成功制备了具有特定抗体的免疫血清，为后续的免疫学研究和临床诊断提供了重要的实验材料。
免疫血清的制备过程复杂而精细，需要严格控制各个环节，以确保免疫血清的质量和稳定性。
实验意义：
免疫血清作为一种重要的实验试剂，在免疫学研究和临床诊断中具有广泛的应
用前景。
通过本实验的制备过程，可以更好地理解免疫反应的机制，为疾病的
诊断和治疗提供重要的实验依据。
同时，免疫血清的制备也为相关领域的科研
人员提供了一种重要的实验技术和方法，有助于推动免疫学研究的进展和应用。
实验一免疫血清的制备及应用（1）免疫血清（溶血素）的制备【实验原理】用绵羊红细胞(SRBC)免疫家兔，可获得抗绵羊红细胞抗体(抗SRBC抗体)。
SRBC与抗SRBC抗体结合，在补体参与下，可出现红细胞溶解，因此抗SRBC抗体也称为溶血素。
【主要试剂与器材】1.健康雄性家兔、绵羊。
2.2%碘酒、75％酒精、无菌生理盐水。
3.0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液。
4.无菌三角瓶(内装玻璃珠)、离心管、吸管、注射器。
5.离心机。
【操作方法】1.抗原制备（1）用碘酒、75％酒精消毒绵羊颈静脉处皮肤，抽血，缓慢注入含有玻璃珠的无菌三角瓶内，轻轻摇动三角瓶，脱纤维抗凝。
抗凝绵羊血用Alsever液可保存2周。
（2）无菌取抗凝绵羊血于离心管中，加适量生理盐水，2000r/min离心5min，吸去上清液和白细胞层，再用较多的无菌盐水与红细胞混匀，离心再弃上清，重复3次，最后一次离心10min。
（3）根据红细胞压积，用0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液配成20％SRBC悬液。
2.免疫动物（1）取健康雄性家兔，通过耳静脉免疫，免疫程序见表1-2。
表1-2 溶血素制备免疫方案【结果判断】收获的抗血清应是无菌、无溶血的。
【注意事项】注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。
【方法评价】溶血素方法简便易行，但是动物个体间产生溶血素质量差异较大。
【临床应用】溶血素可直接用于补体参与的溶血反应，如总补体溶血活性和单个补体成分溶血活性测定。
用溶血素和SRBC做指示系统，可进行补体结合试验。
【思考题】在制备绵羊红细胞过程中为什么要洗涤并吸去红细胞表面的白细胞层?。
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
临床免疫和免疫检验实验指导（一）免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。
一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。
另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。
利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。
制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。
（一）抗原制备和动物的选择1．抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。
抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。
抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。
在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。
2．动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。
在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。
（二）抗原的注射途径和剂量1．注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。
近期发展在局部淋巴结或足等部位注射抗原。
不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。
在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。
2．抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。
3．每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为2~4天。
加佐剂抗原为10~15天。
（三）佐剂的作用原理及种类：1．原理：佐剂又称免疫增强剂。
免疫血清的制备实验报告背景介绍免疫血清是一种含有特异性抗体的血清，它能够识别并结合特定抗原，并在机体内产生免疫反应。
免疫血清在医学、生物学研究以及临床诊断中起着重要的作用。
本文将介绍免疫血清制备的实验过程，以及关键步骤和注意事项。
材料与方法1.抗原：选择具有特定抗原性的物质，如病毒、细菌或蛋白质等。
2.动物：选择适合的动物作为免疫体，如小鼠、兔子或羊等。
3.细菌培养基：提供细菌生长所需的培养基。
4.免疫佐剂：增强机体免疫反应的物质，如佐剂CA等。
5.离心机：用于离心分离血清和细胞。
实验步骤1.抗原制备：根据实验需要，获得相应抗原物质。
如为蛋白质，可通过细菌表达系统获得目标蛋白。
如果抗原是病毒或细菌，需要先进行培养和提取。
2.免疫程序：将抗原注射给动物。
根据具体实验要求，可选择皮下注射、肌肉注射或腹腔注射等途径。
3.免疫佐剂的使用：将适量的免疫佐剂与抗原混合，增强免疫反应。
佐剂通常会激活免疫细胞，增加抗原的摄取和处理。
4.免疫程序的重复：根据需要，可进行多次免疫程序，以增加机体对抗原的免疫反应。
5.血清采集：在免疫程序完成后，采集动物的血液样本。
样本中含有免疫反应产生的抗体。
6.血清的处理：将采集到的血液样本放置在离心管中，进行离心分离。
分离后，得到的液体即为免疫血清。
结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功制备了免疫血清。
制备的免疫血清中含有特异性抗体，能够与抗原结合并产生免疫反应。
免疫血清的制备过程中有几个关键步骤需要注意：1.抗原的选择：根据实验需求选择合适的抗原。
抗原的纯度和性质会直接影响免疫血清的质量。
2.免疫佐剂的使用：合理选择免疫佐剂，能够增强机体的免疫反应，提高抗体产量。
但佐剂的过量使用可能导致免疫反应过度激活，损害动物的健康。
3.血清采集的时间点：根据实验设计，选择合适的时间点采集血液样本。
免疫反应的早期和高峰期通常是采集血清的最佳时间。
4.血清处理的注意事项：血液样本采集后，应尽快进行离心分离，以防止血液凝固。
I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。
它在血清学检测中有广泛应用。
理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。
同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。
制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。
下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。
【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。
2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。
3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。
4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。
5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。
【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。
最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。
2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。
免疫血清的制备实验报告免疫血清的制备实验报告引言：免疫血清是一种重要的生物制剂，具有广泛的应用价值。
本次实验旨在通过制备免疫血清的过程，深入了解其原理和操作方法，并对实验结果进行分析和讨论。
材料与方法：1. 实验动物：选取健康的小鼠作为实验对象。
2. 免疫原：选择抗原A作为免疫原。
3. 免疫程序：按照免疫血清制备的一般程序进行操作，包括初次免疫、强化免疫和采集免疫血清。
4. 实验仪器：包括注射器、离心机、冷藏箱等。
实验步骤：1. 初次免疫：将抗原A与佐剂混合，按照一定剂量通过皮下注射的方式给小鼠进行免疫。
注射后，观察小鼠的一般情况和免疫反应。
2. 强化免疫：在初次免疫后的一定时间内，再次给小鼠注射抗原A，以增强免疫反应。
注射后，继续观察小鼠的免疫反应。
3. 采集免疫血清：在完成强化免疫后，采用静脉穿刺的方式采集小鼠的血液。
将采集到的血液置于离心管中，进行离心分离，得到免疫血清。
结果与分析：通过实验观察，我们发现在初次免疫后，小鼠出现了一系列免疫反应，如体温升高、食欲下降等。
这是由于免疫原激活了小鼠的免疫系统，引发了免疫反应。
在强化免疫后，小鼠的免疫反应进一步加强，体温升高更为明显。
这表明通过多次免疫，可以增强小鼠对抗原A的免疫能力。
通过离心分离，我们成功获得了小鼠的免疫血清。
免疫血清是一种含有高浓度抗体的血浆制剂，具有特异性和高效性。
通过检测免疫血清中抗原A的抗体水平，可以评估免疫血清的制备效果。
我们选取酶联免疫吸附试验（ELISA）作为检测方法，结果显示免疫血清中抗原A的抗体水平显著增高，证明了免疫血清制备的成功。
讨论与展望：免疫血清作为一种重要的生物制剂，在医学、生物技术等领域具有广泛的应用前景。
通过本次实验，我们深入了解了免疫血清的制备原理和操作方法，并获得了一定的实验经验。
然而，免疫血清制备过程中仍存在一些问题和挑战。
首先，免疫原的选择和免疫程序的设计需要根据具体的应用目的进行优化，以提高免疫效果。
免疫血清的制备【实验原理】将适量目的抗原经合适途径注射动物，刺激动物发生免疫应答，产生特异性抗体。
抗体存在于血清中，含有目的抗体的血清称为免疫血清。
高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。
制备方法因抗原的性质不同而异，下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
【材料与仪器】1.健康成年家兔，雄性，体重2～3kg。
2.灭菌生理盐水、纯化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蜡油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。
3.剪刀及镊子、注射器（2ml、50ml）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线及塑料放血管、研钵。
【实验方法】（一）抗原及佐剂的制备1.弗氏不完全佐剂（FIA）的制备：称羊毛脂10g，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml），高压灭菌（55.21kPa20min）后保存备用。
2.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA－IgG）的制备：将FIA预温（60℃30min），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及纯化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，边滴入边研磨，直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上，以不散开为合格。
（二）免疫动物1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮肤。
2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）（简称FCA－IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔10～14天后，于两侧腘窝及足蹊部肿大的淋巴结内注入FCA－IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及足蹊部皮下。
4.间隔7～10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。
免疫血清制备实验报告免疫血清制备实验报告引言：免疫血清制备是一项重要的实验技术，它能够帮助我们了解和应对各种疾病。
本次实验旨在探究免疫血清制备的原理和方法，并验证其在实践中的可行性和有效性。
一、实验目的本实验的目的是制备一种具有高效抗体活性的免疫血清，以应对特定疾病的诊断和治疗需求。
二、实验材料和方法1. 材料：- 实验动物（如小鼠）：用于产生抗体的动物模型。
- 抗原：用于刺激动物产生特异性抗体的物质。
- 细菌培养基：用于培养抗原。
- 免疫佐剂：用于增强免疫反应的辅助物质。
- 高速离心机：用于离心抗体。
2. 方法：- 步骤一：选择合适的实验动物，如小鼠，并注射合适的抗原，刺激其产生特异性抗体。
- 步骤二：收集动物的血清，并离心分离血清中的抗体。
- 步骤三：对抗体进行纯化和浓缩，以获得高效的免疫血清。
三、实验结果和讨论经过实验，我们成功制备了一种高效的免疫血清。
在实验动物注射抗原后，我们观察到动物体内产生了特异性抗体。
通过离心和纯化的步骤，我们成功地分离出了这些抗体，并得到了一种具有高效抗体活性的免疫血清。
免疫血清的制备过程中，选择合适的实验动物和抗原非常关键。
实验动物的种类和抗原的选择应根据所研究的疾病类型和特性来确定。
此外，免疫佐剂的使用也能够增强免疫反应，提高抗体产生的效率。
实验中的离心和纯化步骤对于获得高效的免疫血清至关重要。
离心能够帮助我们分离出血清中的抗体，去除其他无关物质。
而纯化过程则能够进一步提高免疫血清的纯度和活性。
这些步骤的操作需要严格控制，以确保最终获得的免疫血清质量可靠。
四、实验应用和前景制备的免疫血清可以应用于疾病的诊断和治疗。
通过检测患者体内的特定抗体水平，我们可以判断其是否感染了某种病原体或患有某种疾病。
同时，免疫血清也可以用于治疗，通过注射免疫血清，我们可以提供患者所需的特定抗体，帮助其抵抗疾病。
免疫血清制备技术在医学领域具有广阔的应用前景。
随着科学技术的不断发展，我们可以预见，免疫血清制备技术将在疾病的预防和治疗中发挥更加重要的作用。
实验十三免疫化学实验
免疫化学实验包括免疫血清的制备、沉淀反应定量法、对流免疫电泳、单向定量免疫电泳（火箭电泳）、双向定量免疫电泳（交叉免疫电泳）、微量免疫电泳以及单向双向免疫扩散、酶联免疫吸附测定等。
从内容上看这几个实验具有一定的连贯性，是免疫化学最基本的实验方法。
实验(一) 免疫血清的制备
一. 实验目的：制备抗特定抗原的动物抗血清。
二. 器材与试剂：
1. 实验动物：兔子（2500~3000克）
2. 抗原：（小牛血清）
3. 佐剂：福氏完全佐剂
4. 乳化搅拌器
5. 注射器及针头
6. 手术器械：剪刀，手术刀，线，血管钳，塑料导管（ 2mm）
7. 恒温箱
8. 离心机及离心管
9. 三角瓶（100ml）
10. 酒精棉球
11. 叠氮化钠(NaN3)
12. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）
三. 实验方法
制备高效价和高特异性的免疫血清是免疫化学实验的第一步，免疫血清也是免疫学实验必不可少的生物制剂。
实验程序包括动物免疫注射，抗血清效价的测定，全部放血及血清的分离与保存四步。
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项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。
它在血清学检测中有广泛应用。
理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。
同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。
制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。
下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。
【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。
2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。
3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。
4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。
5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。
【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。
最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。
2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。
3．分离血清颈动脉放血(见附录常用实验动物采血方法)，用无菌三角瓶收集血液，等血液凝固后立即轻轻剥离(这是获得大量血清的关键步骤)，放室温2~4h，离心2500r/min 10min，收集血清。
放4℃过夜虽可获得更多血清，但通常更容易溶血。
加入等量甘油，分装，置-20℃保存。
(二)细菌抗血清的制备1．抗原制备将OX19变形杆菌接种柯氏瓶普通琼脂培养基，37℃培养18~24h，用无菌生理盐水将菌苔洗下，吸到有玻璃珠的无菌三角烧瓶中，加入甲醛使终浓度为0.5%，充分振荡使细菌均匀分散。
置4℃24h(或3～5天)杀菌固定，通过无菌试验证实无活菌存在。
应用时同麦氏(Mcfarland) 细菌标准比浊管比浊，将菌液用无菌生理盐水稀释到10亿/ml，置4℃备用。
2．免疫动物家兔耳缘静脉注射菌液，第1、6、11天分别注射0.2ml、0.4ml、1.0ml，第18~21天第4次注射，剂量2.0ml。
末次免疫注射后7～10天，耳静脉取血收集血清，按直接凝集反应(试管法)滴定血清效价，高于1:2000即可颈动脉放血。
否则应追加免疫1~2次，剂量1.0~2.0 ml，间隔期7~10天，若血清效价仍不合格，将家兔废弃，重新选用家兔免疫。
3．分离血清颈动脉放血，收集血清，加入等量甘油，分装，置-20℃保存。
此免疫方法也可用于其它细菌［如伤寒沙门菌H抗原(选用H901菌株)和O 抗原(选用O901菌株)等］抗血清的制备。
(三)人IgG抗血清的制备1．抗原制备取正常人混合血清1ml，加入10%醛化固定的CowanⅠ株金黄色葡萄球菌悬液4ml，置室温30min，其间混匀3~5次。
然后用生理盐水洗7~8次，同麦氏标准比浊管比浊，用生理盐水配成100亿/ml浓度细菌悬液，放4℃备用。
2．免疫动物按表1-1免疫家兔。
表1-1人IgG抗血清制备程序日期第1天第4天第11天第18天第25天注射途径皮下多点注射耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉抗原剂量(ml) 0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 第35天采血用双相免疫扩散法测定抗血清效价，当效价≥1:16时，即可从颈动脉放血收集血清，可加入等量甘油置-20℃保存，也可直接用于提取IgG或特异性抗体。
此免疫方法也可用于制备可与SPA结合的许多动物IgG的抗血清。
(四)人全血清免疫血清的制备1．抗原制备取正常人混合血清，加入等量完全福氏佐剂乳化，乳化完全后即可用于免疫动物。
2．免疫动物第1次背部皮下注射10点，每点0.1ml，共注射加完全福氏佐剂的人全血清1.0ml。
2周后(第15天)两侧腹股沟皮下注射人全血清各0.5ml，以后每周按此注射1次，连续3次(前后共5次)，末次注射后采血用双相免疫扩散法测定抗血清效价，当≥1:16时即可颈动脉放血收集血清，加入等量甘油置-20℃保存。
可用免疫电泳鉴定抗血清反应特性，应出现4~6条沉淀线。
(五)牛血清白蛋白免疫血清的制备1．抗原制备取0.4% BSA(如取40mg BSA加10ml生理盐水溶解配制)，加入等量完全福氏佐剂乳化，乳化完全后即可用于免疫注射。
2．免疫动物第1次注射2.0ml加完全福氏佐剂的BSA，注射部位：四足掌0.8ml(每足掌0.2ml)，大腿肌肉0.6ml(每后大腿0.3ml)，颈部皮下0.6ml(每侧0.3ml)，５周后(第36天)大腿肌内注射BSA 1.0ml(每侧0.5ml)。
1周后试血用双相免疫扩散法测定，当血清效价≥1:16(可在1:64以上)时，即可放血收集血清，加入等量甘油，置-20℃保存。
(六)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原的免疫血清制备1．抗原制备(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，染色，取目的蛋白质斑带(2~3个考马斯亮蓝染色斑带中含10~200μg蛋白质)，弄碎放到含1.5ml蒸馏水或缓冲液的3ml Luer-lock注射器中。
(2)然后将该注射器与另一Luer-lock注射器用一节细管连接起来(不要针头)，来回挤压，直至凝胶被粉碎成均匀细小的碎片。
(3)除去细管，在一支注射器上按上18# 针头，吸入1.5ml完全福氏佐剂。
拔去针头，再按上针头连接装置。
(4)将佐剂缓慢吸到有抗原的注射器中，并用细管将注射器连接起来。
(5)反复抽压，使免疫原和佐剂完全乳化，变稠。
2．免疫动物(1)沿背部两侧皮内注射10~12点，总量0.5~1.0ml ，同时于两肩胛部之间皮内注射0.5ml 。
注入的均为以上制备的完全福氏佐剂乳化的抗原。
(2)3~4周后皮下单点注入不完全福氏佐剂完全乳化的抗原(佐剂与免疫原1:1混合)，注射的抗原量与初次相同(10～200μg )或其1/2 的量。
(3)等动物溃疡愈合，然后用完全福氏佐剂乳化抗原，选择6～8点皮内加强注射。
注入抗原量同初次免疫。
注射后 4 周内常会出现高滴度抗体。
采血，用双相免疫扩散法测抗血清效价，或用免疫印迹法测抗血清反应特性。
3．分离血清颈动脉放血，收集血清，加入等量甘油，置-20℃保存，或提取特异性抗体。
【结果判定】收获的免疫血清应采用各免疫方法中介绍的试验方法或其它血清学方法作最终测定，以确定其效价和反应特性。
并将其鉴定方法，测定的效价及其反应特性，加入的保护剂、防腐剂种类、浓度，免疫动物种类，抗血清名称及保存的开始日期做详细标记和记录。
【注意事项】1．制备抗原、免疫动物、采血和分离血清均应注意无菌操作，以防动物感染和血清污染。
2．采集和收集血液的注射器、器皿应干燥、清洁，以防溶血。
【方法评价】以抗原免疫动物制备的免疫血清，生产的是多克隆抗体。
这种抗血清制备的方法有其固有的缺陷，主要是免疫血清中抗体的特异性具有多样性，可与其它抗原发生交叉反应。
而且不同动物或个体产生的抗体质量不能控制，重复性和稳定性差。
虽然实际工作中单克隆抗体制剂应用十分广泛，但它不可能全部取代多克隆抗体制剂，在临床检测中，多克隆抗体仍有广泛应用。
多克隆抗血清制备方法简单易行，一般实验室均能制备。
【临床意义】免疫血清的应用非常广泛，虽然多有商品供应，但部分诊断血清和科研用免疫血清常需自行制备。
因此制备理想的抗血清是实验室工作的基本技术之一，也是医学检验专业学生应具备的基本技能之一。
【附】 (一)麦氏(McFarland)标准比浊管的配制及使用1．试剂(1)10g/L 氯化钡溶液 取BaCl 2 0.1g ，加蒸馏水10ml ，溶解。
(2)1％硫酸 取H 2SO 4(化学纯，CP)1.0ml ，加蒸馏水至100ml 。
2．配制 取10支大小、粗细、壁质相同的洁净新试管作好标记，按下表1-2制备标准管。
密封试管，悬浮的BaSO 4沉淀物相当于每毫升中大肠杆菌的浓度。
表1-2 麦氏标准比浊管的配制3．使用 将一定量被测菌液加到与标准管相同的试管中，与轻轻混匀的标准管比浊。
于测定管中加入无菌生理盐水，直至浊度与所要求的标准管相同。
按所加入生理盐水的比例稀释原菌液。
或直接比浊测出实际菌含量，按要求再稀释至相应浓度。
管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10g/L BaCl 2(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1％H 2SO 4(ml) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 细菌相当浓度(亿/ml) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30(二)醛化固定SPA细菌的方法1．试剂(1)金黄色葡萄球菌Cowan Ⅰ株细胞壁上含有大量Ａ蛋白(SPA)。
(2)Mueller-Hinton琼脂培养基牛肉300g蛋白胨17.5g可溶性淀粉 1.5g琼脂17g将牛肉去脂肪、筋腱、肌膜，铰碎。
加入1000ml蒸馏水，搅拌均用，置4℃20~24h。
加热，煮沸30~60min，过滤，补足水分至1000ml。
加入上述成分，调pH值为7.4。
115℃~121℃高压灭菌15min(注意不要超过15min！)备用。
(3) PBS(pH7.2 0.01mol/L)Na2HPO4·12H2O 2.58gNaH2PO4·2H2O 0.44gNaCl 8.50g加蒸馏水至1000ml，溶解。
用此液配制以下溶液。
(4)工作PBS 取PBS加入NaN3，溶解，使NaN3终浓度为0.5g/L。
(5)存菌PBS 取PBS加入NaN3，溶解，使其终浓度为1.0g/L。
(6)1.5%甲醛取1.5ml甲醛(市售品浓度约36%~37%，此处当作100%浓度配制)加入PBS至100ml。
