脂类细胞化学（苏丹Ⅲ染色法）
1.实验目的：用苏丹Ⅲ染液对小鼠的肠系膜细胞染色，观察细胞颜色，掌握苏丹Ⅲ染液的
染色方法。
2.实验用品：
（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管
（2）实验药品：蒸馏水、甲醛钙溶液、70%乙醇水溶液、苏丹Ⅲ染液
（3）实验材料：小鼠
3.实验原理：
（1）由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物统称为脂类，这是一类一般不溶于水而溶于脂溶性溶剂的化合物。
脂类是机体内的一类有机大分子物质，它包括范围
很广，大体上可以分为类脂和油脂两大类。
类脂包括磷脂(phospholipids)，
糖脂(glycolipid)和胆固醇及其酯(cholesterol and cholesterol ester)三
类。
而油脂可以分为常温下常温液态的油和常温下固态的脂肪两类。
这几种
脂类化学结构有很大差异，生理功能各不相同。
其共同物理性质是不溶于水
而溶于有机溶剂，在水中可相互聚集形成内部疏水的聚集体。
（2）在固定细胞时，通常使用脂溶性固定液。
然而，鉴定的材料是脂肪时，脂溶性的固定液会溶解脂肪，致使把切片放到显微镜下观察时，观察不到被
染色的脂肪，只能看到脂肪细胞中有很大的空洞。
最好的固定材料是甲醛类
的固定液。
如医学上保存尸体采用的是福尔马林，即40%的甲醛水溶液，本次
实验采用的则是甲醛钙溶液。
（3）光学显微镜的切片多是石蜡切片。
在熔接石蜡时，需要用到脂溶性溶剂，而脂溶性溶剂会溶解细胞中的脂肪，因此本次实验不可采用石蜡切片。
但是
锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等有机溶剂，可以采用石蜡切片。
（4）制作切片有多种方法，如冰冻切片、明胶包埋冰冻切片、本次实验采用的是操作简单的铺片法。
（5）脂类染色的原理是，染料溶于脂类显色。
选择溶剂时应注意，溶剂必须既溶解的染料，又不溶解掉脂类。
4.实验步骤：
（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
剪开腹腔，用镊子提起小肠，使盖玻片紧贴于肠系膜。
用剪子将连同盖玻片和其上粘的肠系膜剪下，反扣于已
滴加甲醛钙的载玻片上，固定15分钟,
（2）吸蒸馏水滴于载玻片、载玻片之间冲洗，用滴管不断吸取液体以去除固定液。
（3）用70%的乙醇水溶液代替蒸馏水重复上一步骤，进行冲洗。
（4）用苏丹Ⅲ染液染色30mins。
（5）染色结束时，用吸水纸吸去多余染液。
擦净盖玻片周边及表面，用显微镜观察。
5.实验结果：脂肪细胞被苏丹Ⅲ染液染成橘红色。
细胞周围有溢出的脂肪粒，呈圆形，橘
红色。
10*4显微镜下观察：
10*10显微镜下观察：
10*40显微镜下观察：
6.分析与讨论
（1）结果分析：脂肪细胞中含有大量脂肪，脂肪被苏丹Ⅲ染液染成橘红色，因而使整个细胞呈现橘红色。
某些脂肪细胞破裂，而使脂肪溢出，呈橘红色
的圆球状。
（2）注意事项
①在用盖玻片贴肠系膜：由于小鼠的肠系膜很小，因而应该提前缩小盖玻片的尺
寸。
可以用剪刀剪或用手掰小，并尽量使最后的盖玻片呈正方形。
②肠系膜的选择：肠系膜是一层包裹在小肠外的很细的薄膜，这层膜的大部分地
方是没有脂肪细胞的。
但是，肠系膜血管的周围有一些起保护作用的脂肪细胞。
因此，选材时应注意选择含有血管的肠系膜。
但是有一些血管周围的脂肪细胞
非常厚，肉眼可见呈白色。
这样的地方是无法观察的，所以选材时还要注意材
料的透明度。
③染色：染色过程为30mins，在这一过程中，染料中的水分很有可能蒸发，因此
在染色过程中应不时向载玻片中滴加染料。
④观察：在把物镜由10倍转为40倍时，应考虑到物镜变长，可能会使镜面蹭到
小鼠的小肠。
在观察时可先将小肠切除，只观察肠系膜。
⑤观察：观察时如果血管呈红色，是由于放血时没有放干净，下次实验应该注意
（3）作业：糖类的鉴定
Molisch反应（α- 萘酚反应）：此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。
它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α- 萘酚作用，形成红紫色复合物。
由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。
α- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与α- 萘酚一样。
除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。
因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应只能说明有糖类存在的可能。
此反应不能鉴别多聚糖如淀粉，纤维素等。
Benedict反应：班氏试剂是斐林试剂的改良（也是含有Cu2+的碱性溶液），能使具有自由醛基或酮基的糖类氧化，其本身则变成砖红色或黄色的Cu2O，可用来测定还原糖的存在。
它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比斐林试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。
Bial反应（甲基间苯二酚反应）：戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在的条件下，它与甲基间苯二酚（地衣酚）缩合，形成深蓝色的沉淀物（此沉淀物溶于正丁醇）。
己糖也能发生反应，产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。
Molisch反应（α- 萘酚反应）：此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。
它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α- 萘酚作用，形成红紫色复合物。
由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。
α- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与α- 萘酚一样。
除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。
因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应只能说明有糖类存在的可能。
Seliwanoff反应：同样的原理，将糖与浓酸作用后再与间苯二酚反应，若是酮糖就显鲜红色，若是醛糖就显淡红色，由此可鉴别酮糖和醛糖。
蒽酮反应：糖类经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）反应生成蓝绿色复合物。
Barfoed test ：检验单糖的一种试验。
将5ml的Barfoed试剂煮沸，在保持其沸腾情况下缓慢地加入待检物。
单糖还原比混合物，形成红色沉淀物；而双糖虽亦能还原，但反应甚慢，可与前者区别。
脂肪的鉴定：脂肪可用?苏丹Ⅲ染液、苏丹Ⅳ染液、油红染色进行鉴定
蛋白质的鉴定：常用的试剂是双缩脲试剂。
其原理是：碱性条件下，双缩脲H2N-CO-NH-CO-NH2可以和Cu离子作用生成紫色沉淀。
蛋白质中有很多和双缩脲结构相似的肽键，所以可以用双缩脲试剂来鉴定蛋白质。
