考点加强课6 微生物的筛选、鉴定、分离与计数.doc

重点题型1目标微生物的筛选与鉴定1.分离微生物的原理与措施（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离，再给细胞提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。

（2）常用措施①接种过程中尽量使细胞分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。

②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。

2.选择培养基四种常见制备方法或实例【例证1】（2017·全国卷Ⅰ，37）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。

回答下列问题：（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生。

能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________（答出两点即可）。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是__________________________________。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有______________________________________________（答出两点即可）。

解析（1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。

能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。

能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐。

答案（1）脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料（2）尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用（3）为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定【例证2】 （2014·全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。

回答下列问题。

（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将 分解成 。

（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR ）时，CR 可与纤维素形成 色复合物。

用含有CR 的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的 。

（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 CR 溶液 水 培养基甲＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 培养基乙 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋注：“＋”表示有，“－”表示无。

据表判断，培养基甲 （填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 ；培养基乙 （填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________。

解析 （1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。

纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，如下图：纤维素――→C 1酶、C x 酶纤维二糖――→葡萄糖苷酶葡萄糖（2）刚果红可与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（3）分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素为唯一碳源。

答案 （1）纤维二糖 葡萄糖 （2）红 透明圈（3）不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR —纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌1.（2019·湖南、江西十四校联考）马、牛羊的食物主要是草茎类，其中还有大量的纤维素。

它们胃内的微生物，在帮助消化和利用植物纤维素方面起了决定性的作用，土壤中也存在着分解纤维素的微生物。

请根据所学的知识，回答下列问题：（1）纤维素酶是一种复合酶，主要包括、、。

（2）在培养基中进入刚果红染液可以鉴别纤维素分解菌，其原因是____________________________________________________________________。

（3）分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是。

①稀释倒平板法②涂布平板法③单细胞挑取法④选择培养分离A.①②B.②③④C.②③D.①③④（4）在微生物的分离与培养的过程中，为了防止杂菌的污染，需要进行严格的无菌操作，如接种环和接种针需要，培养基需要等。

（5）下表为鉴别纤维素分解菌的培养基配方，请判断该培养基为培养基，酵母膏和土豆汁在实验中的作用是_____________________________。

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

解析（1）纤维素酶包括C1酶、C X酶和葡萄糖苷酶。

（2）刚果红染液可以与纤维素结合形成红色的复合物，纤维素分解菌产生的纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖而使其菌落周围出现透明圈，所以在培养基中加入刚果红染液可以鉴别纤维素分解菌。

（3）分离土壤中纤维素分解菌，先进行选择培养，增大纤维素分解菌的浓度，梯度稀释，涂布平板、培养，单细胞挑取以获得纯培养，②③④正确；稀释倒平板法是先进行梯度稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50 ℃左右的琼脂培养基混合、摇匀后，倾入灭菌的培养皿中，制成可能含菌的琼脂平板，保温一定时间即可出现菌落，①错误。

（4）在微生物的分离与培养的过程中，接种环和接种针需要灼烧灭菌，培养基需要高压蒸汽灭菌。

（5）根据表格分析，该培养基中有琼脂，因此为固体培养基；酵母膏和土豆汁在实验中的作用是为纤维素分解菌提供生长因子。

答案（1）C1酶C X酶葡萄糖苷酶（2）刚果红染液可以与纤维素结合形成红色的复合物，纤维素分解菌产生的纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖而使其菌落周围出现透明圈（3）B（4）灼烧灭菌高压蒸汽灭菌（5）固体提供生长因子2.亚硝胺广泛存在于化工类废水中，对环境有严重危害。

某研究小组欲从处理废水的活性污泥中分离纯化亚硝胺降解高效菌株。

请回答下列问题：（1）泡菜腌制过程中产生的在特定的条件下也会转变成亚硝胺，对人体健康产生危害，所以在泡菜腌制过程中，要注意控制腌制的和食盐的用量。

（2）选择培养时的培养基只能以作为唯一氮源，经灭菌后用于富集亚硝胺降解菌。

（3）分离纯化出3种亚硝胺降解高效菌株，为了比较3种菌株的降解效率，将等量的3种菌株接种于富含亚硝胺的培养基，一组不接种作为空白对照，一段时间后测定4组培养基中亚硝胺的。

设置空白对照的目的是______________________________________________________。

（4）在上述实验的基础上研究亚硝胺降解高效菌株混合使用的降解效率，理论上还需要设计组实验。

解析（1）泡菜腌制过程中产生的亚硝酸盐在特定的条件下也会转变成亚硝胺，所以在泡菜腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。

（2）培养基只能以亚硝胺作为唯一氮源，经高压蒸汽灭菌后用于富集亚硝胺降解菌。

（3）亚硝胺菌株的降解效率，可根据反应物的剩余量（即亚硝胺的剩余量）来判断，设置空白对照的目的是排除亚硝胺自然降解对实验结果的影响，以保证本实验的结果是由菌株引起的。

（4）3种亚硝胺降解高效菌株，如研究亚硝胺降解高效菌株混合使用的降解效率，可从3种亚硝胺中任取两种，有3种组合，3种亚硝胺混合1种组合，因此理论上还需要设计4组实验。

答案（1）亚硝酸盐时间、温度（2）亚硝胺高压蒸汽（3）剩余量（含量）排除亚硝胺自然降解对实验结果的影响，以保证本实验的结果是由菌株引起的（4）4重点题型2微生物的分离与计数微生物计数的方法专项归纳1.间接计数法（也叫活菌计数法）常用的是稀释涂布平板法。

（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。

（2）操作：①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。

为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中的细菌数＝（C/V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。

[提醒]此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

2.显微镜直接计数法（1）原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

（2）方法：用计数板计数。

（3）缺点：不能区分死菌与活菌。

（4）操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，稍等片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

点悟：（1）计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成的。

（2）计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

3.滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红—美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。