食品中蛋白质的测定

1. 目的

掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。

2. 原理

蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。

3. 试剂

3.1 浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制

3.2 混合指示液

1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

3.3 氢氧化钠溶液（400g/L）

3.4 标准滴定溶液

硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl）0.0500mol/L］

3.5 硼酸溶液（20g/L）

4. 仪器

定氮蒸馏装置

5. 样品

全蛋（2.47g）

6. 操作

6.1 样品处理

准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

6.2 连接装置

装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热至水沸腾。

6.3 蒸馏、吸收及滴定

向接收瓶（锥形瓶）内加入10mL20g/L硼酸溶液及混合指示剂1-2滴，并使冷凝管的下端插入液面下。用移液管移取10.00mL样品消化稀释液有小漏斗室流入反应室，在将10mL 400g/L氢氧化钠溶液倒入碱液管中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，并加水于小漏斗中以防止漏气。开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，是冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量的水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05 mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝色变为微红为终点，记录盐酸溶液用量。

蛋白质含量的测定

衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。

一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。

一、目的与要求：

掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消

化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。

二、原理：

凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。

(1) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2

(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器：

1、硫酸钾

2、硫酸铜

3、硫酸

4、2％硼酸溶液

5、40％氢氧化钠溶液

6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．

7、0.OINHCL标准溶液或0．01N硫酸标准溶液．

8、凯氏微量定氮仪一套。

9、定氮瓶100m1或50ml一只。

10、三角瓶150ml 3只。

11、量筒50ml、lOml、lOOml。

12、吸量管10ml只。

13、酸式滴定管1支。

14、容量瓶100毫升1只。

15、小漏斗1只。 四、操作方法：

1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。 2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

实验七 食品中蛋白质的测定

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

2 分析步骤

2.1 试样处理：称取0.20g～2.00g固定试样或2.00g～5.00g半固体试样或吸取10.00ml～25.00ml液体试样（约相当氮30mg～40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沸腾，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h～1h。取下放冷，小心加20ml水。放冷后，移入100ml容量瓶中。并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

2.2 测定：按上图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至三分之二处，加入数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 2.3 向接收瓶内加入10ml硼酸溶液（20g/L）及1～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，准确吸取10ml试样处 理液由小漏洞流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，棒状玻塞塞紧。将10ml氢氧化钠溶液（400g/L）倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧。并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏5min。移动接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液（0.05mol/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取10ml试剂空白消化液按2.2操作。

食品中蛋白质的测定方法

食品中蛋白质的测定是一项重要的分析工作，因为蛋白质是构成生物体的重要组成部分，具有多种生理功能。在食品分析中，蛋白质的测定可以帮助确定食品的营养价值、质量和安全性。目前常用的食品中蛋白质测定方法主要包括化学方法、生物方法和光谱法等。

化学方法是常用的测定蛋白质含量的方法之一。常见的化学方法有碱式溴酸法、Lowry法、比色法和生物素-亲和素ELISA法等。碱式溴酸法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，其原理是根据蛋白质与碱式溴酸反应产生溴化物，通过溴离子与物质之间的比色测定来确定蛋白质的含量。此方法操作简便、操作范围较宽，但其并不是选择性很高的方法，也不能区分不同的蛋白质。

Lowry法是一种常用的反应性蛋白质测定方法，其基本原理是根据酚与蛋白质或肽链中的酰化基团的反应，在碱性条件下生成一种可变色的络合物，并使用多肽键和酰化基团的浓度作为测定蛋白质含量的依据。该方法具有较高的选择性和灵敏度，广泛应用于食品中蛋白质含量的测定。

比色法是一种常用的定量分析方法，可以通过测定浓度与溶液的吸光度之间的关系来确定溶液中蛋白质的含量。其中一种常用的比色法是布拉德福德法，原理是将蛋白质与染料交换的方式，根据染料与蛋白质之间的作用力来测定蛋白质的含量。这种方法需要一定量的标准蛋白质作为参照物，但是不同的蛋白质可能对染料的亲和力不同，因此需要根据具体情况进行一定的修正。

生物素-亲和素ELISA法是近年来发展起来的一种新的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用免疫学的方法来检测样品中的蛋白质含量。这种方法需要特异性抗体与特定蛋白质结合，然后用辣根过氧化物酶二抗体与结合的抗体结合，最后根据酶的活性来测定蛋白质的含量。这种方法可以用于测定食品中特定蛋白质的含量，并且具有较高的选择性和敏感性，但需要较长的实验时间和昂贵的试剂。

除了化学方法外，生物方法也可以用于食品蛋白质的测定。生物方法主要指的是生物学指标法，根据生物体内生物学分子的活性来测定样品中物质的含量。常见的生物方法有生物传感器、酵素法和免疫法等。食品中蛋白质的测定可以利用生物传感器来进行，生物传感器是一种将生物材料与化学传感器结合的设备，可以通过生物材料与目标物质的生物特性相互作用来测定蛋白质的含量。酵素法是一种利用酶的催化作用来测定物质含量的方法，可以通过测定酶与底物的反应来确定蛋白质的含量。免疫法是一种利用抗原与抗体的特异性结合来测定物质含量的方法，可以通过测定抗体与蛋白质的结合来确定样品中蛋白质的含量。