rnai技术原理
RNAi技术原理。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种特殊的基因沉默技术，通过特异性降解靶基因的mRNA，从而抑制靶基因的表达。RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域。本文将介绍RNAi技术的原理及其在生物学研究中的应用。
RNAi技术的原理主要包括三个步骤，siRNA合成、RNA诱导靶基因沉默和RNA诱导沉默的效应。首先，siRNA由外源DNA转录而来，或由细胞内Dicer酶切割长双链RNA产生。siRNA由RISC复合物识别并结合，导致RISC复合物介导的靶基因mRNA降解。最终，靶基因的表达被抑制，从而实现基因沉默的效果。
RNAi技术在基因功能研究中有着广泛的应用。通过合成siRNA，研究人员可以选择性地沉默感兴趣的基因，从而研究其功能。利用RNAi技术，研究人员可以验证基因的功能、探索信号通路、筛选药物靶点等。此外，RNAi技术还被应用于疾病治疗领域。通过设计siRNA靶向疾病相关基因的mRNA，可以实现对疾病基因的特异性沉默，为基因治疗提供了新的途径。
除此之外，RNAi技术还在农业生物技术领域发挥着重要作用。利用RNAi技术，可以设计siRNA靶向害虫或病原体的基因，从而实现对害虫或病原体的生物防治。此外，RNAi技术还可以用于改良作物品质、提高作物产量等方面。
综上所述，RNAi技术作为一种重要的基因沉默技术，具有广泛的应用前景。通过深入理解RNAi技术的原理，研究人员可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域的发展。RNAi技术的不断创新和应用将为生命科学领域带来更多的突破和进展。
rnai的原理
RNAi的原理。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由外源双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的现象，是一种高度保守的生物现象，存在于真核生物的细胞中。RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生产等领域。本文将介绍RNAi的原理及其在基因沉默中的作用机制。
RNAi的原理主要包括三个步骤，RNA干扰诱导、RNA干扰信号放大和RNA干扰效应。首先，外源dsRNA或内源miRNA被切割成21-23个碱基的小RNA片段，这些小RNA片段与RNA诱导靶向基因沉默的复合物结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。RISC可将小RNA片段的信息传递到靶标mRNA上，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而实现基因的沉默。
RNAi在基因沉默中的作用机制主要涉及到两种小RNA，siRNA和miRNA。siRNA是由外源dsRNA切割产生的，可以完全匹配靶标mRNA序列，导致mRNA的降解；miRNA则是由内源基因产生，与靶标mRNA序列部分匹配，主要导致翻译抑制。siRNA和miRNA都能通过RISC介导的方式实现基因的沉默，从而调控细胞的生理过程。
RNAi技术在基因功能研究中有着重要的应用。通过合成siRNA或miRNA，可以特异性地沉默目标基因，从而研究其在细胞信号传导、代谢途径、细胞周期等生物学过程中的作用。此外，RNAi技术还可以应用于疾病治疗，例如利用siRNA沉默病毒基因或致病基因，治疗病毒感染或遗传疾病。在农业生产中，RNAi技术也可以用于抗虫、抗病和改良作物品质等方面。
总之，RNAi作为一种高效、特异性的基因沉默技术，已经成为生命科学研究和生物技术应用中的重要工具。通过深入理解RNAi的原理和作用机制，我们可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生产的发展。
第25卷第4期2004年7月 江苏大学学报(自然科学版)JournalofJiangsuUniversity(NaturalScienceEdition) Vol.25No.4July2004 RNAi技术研究进展陈克平,唐旭东(江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013)摘要:RNAi是由双链RNA引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使目的基因发生特异性沉默.目前,获得siRNA已经非常方便,导入方式最常用的是微注射.RNAi技术有编码区RNAi和启动子区RNAi两大类,均可以产生类似基因敲除的功能,在家蚕功能基因的研究中已经使用了这种方法.随着RNAi技术的不断进步,RNAi可广泛地应用到功能基因组学,药物靶点筛选,疾病治疗等方面.关键词:RNAi;基因功能;RNAi技术中图分类号:Q756 文献标识码:D 文章编号:1671-7775(2004)04-0336-05AdvancesonresearchofRNAinterferenceCHENKe2ping,TANGXu2dong(InstituteofLifeScience,JiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212013,China)Abstract:RNAiisaphenomenonofgenesilenceinducedbydouble2strandedRNA(dsRNA)thatishomolo2goustotargetgene.NowitiseasytoobtainsmallinterferenceRNA(siRNA),andsiRNAisoftentransmittedintoorganismsbymicroinjection.RNAiincludesencodingregionRNAiandpromoterregionRNAi,whichcanbeusedtoinvestigategenefunctionbydegradingaspecialmRNAtargetinacellororganismandthusknock2ingoutorknockingdowntheleveloftheencodedprotein.Theyhavebeenusedtotheanalysisofsilkwormgenefunction.Withthedevelopmentofthetechnique,RNAicanbewidelyusedtogenomicanalysis,medica2tiontargetscreening,diseasetreatmentandsoon.Keywords:RNAi;genefunction;RNAitechnology RNAi(RNAinterference)是由双链RNA引发的转录或转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilenc2ing,PTGS).长dsRNA被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,与具有序列同源性的mRNA结合并使之降解,从而抑制基因的表达.目前已成功地在果蝇、线虫、锥虫、小鼠和哺乳动物中进行了RNAi研究,其机制也逐渐被认识.由于其具有的独特优势,有望成为研究基因功能和进行基因治疗的有力工具.1 RNAi的产生与发展20多年前,RichardJorgensen在研究改变色素的转基因矮牵牛时发现,导入色素外源基因并没有产生预期的花色加深,反而因为某些色素的缺失出现花色斑驳的现象.这表明不仅转进去的基因自身没有活性,外源DNA序列还在一定程度上对内源性基因表达产生阻断,把这种现象称为共抑制[1-3].1995年,美国华盛顿大学的Guo和Kemphues[2]在研究线虫Caenorhabditiselegans中发现,用反义和正义RNA同样都有抑制par-1基因的表达.3年后(1998年),Fire和Mello及他们的研究组尝试使用反义RNA、正义RNA、dsRNA的阻断效应实验,发现作为沉默引发物的dsRNA混合物比单个收稿日期:2004-01-16基金项目:江苏省高新技术项目(BG2001317);国家财政部家蚕基因组计划技术平台建设项目作者简介:陈克平(1960-),男,安徽无为人,研究员,博士生导师(kpchen@),主要从事家蚕种质创新和家蚕功能基因组学的研究1正义或反义RNA至少强10倍[4],他们把这种现象称为RNA干涉(RNAinterference,RNAi)[5].RNAi在自然界中广泛存在,目前已经在植物、真菌、囊虫、果蝇、线虫、鼠早期胚胎细胞、家蚕等不同种属的生物体中得到证实[6-8].由于它能够特异性地使一些基因得到沉默,所以可以代替基因敲除等研究特定基因的功能.随着人类基因组计划测序工作的完成,人类将进入后基因组时代即研究功能基因组学时代,确定特定基因的功能,迫切需要一种简单经济的方法进行研究,RNAi以其独特的优势越来越受遗传学家和生物学家的重视,其机理也逐渐被人们阐明.2 RNAi干涉的机制随着遗传和生化方面的研究不断深入,人们开始逐步了解RNAi的发生机制.初步认为RNAi主要分为三个阶段(图1).
慢病毒介导的RNAi技术
一、概述
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转入细胞内转录siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点：
● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。
● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。
● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin可以在2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。
慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图 1。
