水质 粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用水果湖样点水样）。

本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，37℃下培养24h，观测结果。

产酸产气为阳性结果，不产酸产气为阴性。

将阳性管中菌液取定量接种于EC肉汤培养液中，45℃下培养24h，观测结果。

产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。

将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，于对应温度下培养24h，镜检。

根据菌落形态和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。

根据大肠杆菌阳性管数的MPN检索可查水样中总大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。

再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)对比，判定水质。

【关键词】环境水样大肠杆菌耐热大肠杆菌多管发酵法最大或然数（MPN）产酸产气【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。

大肠杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，使两种染料结合成复合物，使菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。

耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，由于它多见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。

当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。

【材料与方法】：（一）材料乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管20支）EC肉汤培养基：胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管10支）伊红美蓝培养基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml （150ml/瓶）4.5 mL无菌水：4支（二）器材无菌1 mL移液管：4支；40~200 微升移液器、吸气器：各1支；200微升无菌Tip：20只；载玻片和盖玻片若干；革兰氏染色各试剂；培养皿若干套；酒精灯；显微镜等（二）原理及方法1、样品的稀释和培养：取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成 10-1样品；再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。

有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定大肠菌群的检验方法，以按标准化进行操作。

2 适用范围适用于大肠菌群检验。

3 术语大肠菌群：在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌。

4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。

5 流程图无6 作业内容6.1 设备和材料净化工作台、培养箱（36±1℃）、新飞展示柜（0-10℃）、刻度吸管（10mL）、试管（18×200mm）、酒精灯、镊子、放大镜、培养皿、三角瓶（500mL）、显微镜等、40孔口的试管架、洗耳球等实验器材6.2 培养基和试剂75%酒精、生理盐水（0.9%）、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液等培养基及试剂。

6.3 操作步骤6.3.1 样品处理一般情况下，产品没有受到污染，按照以下方法检验：取待检样品10mL接种于含10mL双料乳糖胆盐发酵管内,接种5管，置于36±1℃生化培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，按下列程序进行。

6.3.2 分离培养从产酸产气的发酵管中用接种环挑取样液，划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃生化培养箱内，培养18-24h。

取出观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

6.3.3 证实试验有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页用接种环挑取疑似大肠菌群菌落（菌落呈黑紫色，表面有金属光泽），接种于乳糖发酵管内，置36±1℃生化培养箱内培养24±2h。

同时对上述可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。

凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

6.3.4 MPN值计算及报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL样品中大肠菌群的最可能数。

方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。

2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。

44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。

通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。

2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。

3.主要仪器3.1 净化工作台。

3.2 立式高压蒸汽灭菌器。

3.3恒温恒湿培养箱。

3.4电热恒温鼓风干燥箱。

3.5电子天平。

3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。

4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。

5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。

对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。

当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。

按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。

水质粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。

在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。

一般水样特指除医院污水外的各种水样。

本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。

1.2方法原理多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。

它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。

1.3水环境质量标准表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002）表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005）a 加工、烹调及去皮蔬菜b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001）2分析方法2.1方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。

2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。

2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。

必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。

接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。

水质粪大肠菌群的测定℃温度下能发展并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群.用进步造就温度的办法,造成晦气于来自天然情形的大肠菌群发展的前提,使造就出来的菌重要为来自粪便中的大肠菌群,从而更精确地反应出水质受粪便污染的情形.粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法.第一篇多管发酵法1. 实用规模本尺度实用于地表水.地下水及废水中粪大肠菌群的测定.2. 道理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN来暗示实验成果的.现实上它是依据统计学理论,估量水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种办法.假如从理论上斟酌,并且进行大量的反复检定,可以发明这种估量有大于现实数字的偏向.不过只要每一稀释度试管反复数量增长,这种差别便会削减,对于细菌含量的估量值,大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度.是以在实验设计上,水样磨练所请求反复的数量,要依据所请求数据的精确度而定.3. 造就基和试剂本尺度所用试剂除尚有注明外,均为相符国度尺度的剖析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水.3.1单倍乳糖蛋白胨造就液：成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨.牛肉浸膏.乳糖.氯化钠加热消融于1000mL 蒸馏水中,调节pH为7.2～7.4,再参加 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用.3.2 三倍乳糖蛋白胨造就液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外）,配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨造就液,制法同上.3.3 EC造就液：成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4） 4g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加热消融,然后分装于含有玻璃倒管的试管中.置高压蒸汽灭菌器中,115℃灭菌20min.灭菌后pH应为6.9.3.4 造就基的存放在密封瓶中的脱水造就基成品要存放在大气湿度低.温度低于30℃的暗处,存放时应防止阳光直接照耀,并且要防止杂菌侵入和液体蒸发.当造就液色彩变更,或体积变更显著时放弃不必. 4. 步调4.1 水样接种量将水样充分混匀后,依据水样污染的程度肯定水样接种量.每个样品至罕用三个不合的水样量接种.统一接种水样量要有五管.相对未受污染的水样接种量为10mL.1mL.0.1mL.受污染水样接种量依据污染程度接种1mL.0.1mL.0.01mL或0.1mL.0.01mL.0.001mL等.应用的水样量可参考下表1.表1 接种用水量参考表＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿接种量(mL）水样种类检测办法 100 50 10 1 0.1 10-210-310-4 10-5井水多管发酵法×××河水.塘水多管发酵法×××湖水.塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨造就液5mL;如接种量为1mL或少于 1mL,则可接种于通俗浓度的乳糖蛋白胨造就液10mL中.4.2 初发酵实验将水样分离接种到盛有乳糖蛋白胨造就液的发酵管中.在37℃±℃下造就24h±2h.产酸和产气的发酵管标明实验阳性.如在倒管内产气不显著,可轻拍试管,有吝啬泡升起的为阳性.4.3 复发酵实验℃±℃温度下造就24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中造就基液面）.接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中.造就后立刻不雅察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性.5．成果的盘算依据不合接种量的发酵管所消失阳性成果的数量,从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群.接种水样为100mL2份.10mL10份.总量300mL时,查表2可得每升水样中的粪大肠菌群;接种5份10mL水样.5份1mL水样.5份0.1mL水样时,查表3求得MPN指数,MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群.。

粪大肠菌群的测定1、方法依据水质粪大肠菌群的测定多管发酵法 H J/ T 3 47-20072、适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。

3、测定原理多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌的密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。

因此在实验室设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

4、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。

3、1 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 1000ml制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

3、2 三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。

3、3 EC培养液成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾 4g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000ml制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。

置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。

灭菌后pH应为6.9。

3、4 培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。

当培养液的颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。

4、步骤4、1 水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样的接种量。

密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码1/81.0 水源水1.1 范围本法适用于天然泉水水源水大肠菌群的检验。

1.2 原理根据大肠菌群细菌具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN值。

1.3 培养基和试剂1.3.1 乳糖胆盐发酵培养液。

1.3.2 亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）。

1.3.3 灭菌生理盐水。

1.4 仪器1.4.1 超净工作台。

1.4.2 高压蒸汽灭菌锅。

1.4.3 培养箱：36℃±1℃。

1.4.4 冰箱：0℃～8℃1.4.5 电子天平：感量0.1g。

1.4.6 培养皿。

1.4.7 小倒管。

1.4.8 试管：150mm×20mm,140mm×15mm。

1.4.9 吸管：10mL、5mL、1mL。

1.4.10 接种环。

1.4.11 酒精灯。

1.5 检测步骤1.5.1 推测性检验1.5.1.1 吸取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。

1.5.1.2 吸取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。

1.5.1.3 另吸取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水中，混匀，用5mL灭菌吸管吸取5mL稀释液，分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，每管1mL（即0.1mL水样）。

轻摇试管，使液体充分混合，置36℃±1℃培养箱内培养24h。

观察每支管是否产气，若有气体产生该管则为推测性检验阳性。

如不产气则为大肠菌群阴性。

密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码2/81.5.2 确证性试验1.5.2.1 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）管中，置36℃±1℃培养箱中培养48h。

1.5.2.2 观察BGB管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为“大肠菌群阳性”；如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。

水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质水中总大肠菌群的测定多管发酵法2、适用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。

主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。

总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。

如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。

但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。

3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。

多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。

因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

4、试剂4.1 乳糖蛋白胨培养液:蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g氯化钠 5g乳糖 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 100ml将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。