P0006%20Bradford蛋白浓度测定试剂盒

蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。

二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。

考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail ：****************** 技术咨询：***************** 网址：碧云天网站 微信公众号BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)产品编号 产品名称包装 P0009BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)5000次产品简介：BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型) (Enhanced BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA 法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单、高稳定性、高灵敏度和高兼容性。

和碧云天生产的普通BCA 蛋白浓度测定试剂盒相比，灵敏度更高，检测浓度下限达到10µg/ml ，最小检测蛋白量达到0.2µg ，待测样品体积为1-20µl 。

和碧云天生产的普通BCA 蛋白浓度测定试剂盒相比，显色速度更快，相同的样品孵育较短时间即可进行吸光度测定。

在20-1000µg/ml 浓度范围内有较好的线性关系。

本产品从0.025到0.5mg/ml 的标准曲线参考图1。

图1. 本试剂盒蛋白标准曲线的效果图。

左图为加入BCA 工作液后37ºC 分别孵育30、60和120分钟后的吸光度实测效果图，右图为37ºC 孵育60分钟时的实拍显色效果图。

图中数据仅供参考，实际的检测效果可能会略有不同。

BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS ，5%的Triton X-100，5%的Tween20、60、80。

但本试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA 低于10mM ，无EGTA ，二硫苏糖醇(DTT)低于1mM ，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。

不适用BCA 法时建议试用碧云天生产的Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(P0006)。

Bradford蛋白质浓度定量试剂盒产品说明书（中文版）主要用途Bradford蛋白质浓度定量试剂是一种旨在使用考马斯亮蓝染色剂G－250与可溶性蛋白质特异性结合产生色彩差异变化，通过比色测定其最大吸收转换来定量蛋白质浓度的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种蛋白质（动物、人体、植物、微生物等）的含量检测。

产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感，定量精确。

技术背景考马斯亮蓝染料G－250（Coomassie Brilliant Blue G－250）是一种与蛋白质结合的化学染料。

它的三苯甲烷（triphenylmethane）基团，主要与蛋白质的非极性结构结合。

而它的阴离子磺酸盐（anion sulfonate）基团与蛋白质分子的阳离子和芳香类氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸侧链的结合。

在酸性环境下，其最大吸收波长从465nm转换为595nm。

Bradford提出的方法的最大优点在于不受样品中各种化学成分的干扰。

较之Lowry，Hartree-Lowry和 BCA技术，更为敏感。

产品内容反应液（Reagent A）毫升标准液（Reagent B）毫升补充液（Reagent C）毫升产品说明书1份保存方式保存标准液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，反应液（ReagentA），避免光照；有效保证6月用户自备48孔板：用于样品比色的容器比色杯：用于样品比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、48孔板微量测定A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备1个48孔板，做好相应的标记3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到48孔板里指定序号的样品孔里2）分别移取适量的补充液（Reagent C）到48孔板里指定序号的样品孔里3）最后分别加入100微升反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（微克）1 25微升 375微升 100微升252 12.5微升 387.5微升 100微升12.53 10微升 390微升 100微升104 5微升 395微升 100微升 55 2.5微升 397.5微升 100微升 2.56 1.25微升 398.75微升 100微升 1.257 0 400微升 100微升04．轻轻摇动48孔板，混匀反应物5．室温下暗室里孵育5分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．分别移取100微升待测样品到48孔板里指定序号的样品孔里（注意：参见注意事项4）3．分别移取300微升补充液（Reagent C）到48孔板里指定序号的样品孔里4．最后分别加入100微升反应液（Reagent A）5．轻轻摇动48孔板，混匀反应物6．室温下暗室里孵育5分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以100微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）二、比色杯标准测定A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备好1毫升比色杯3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到1毫升比色杯2）分别加入适量的补充液（Reagent C）3）最后分别加入200微升GENMED反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（微克）1 50微升 750微升 200微升502 25微升 775微升 200微升253 20微升 780微升 200微升204 10微升 790微升 200微升105 5微升 795微升 200微升 56 2.5微升 797.5微升 200微升 2.57 0 800微升 200微升04．轻轻上下倾倒比色杯，混匀反应物5．室温下暗室里孵育5分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．移取200微升待测样品到1毫升比色杯里（注意：参见注意事项4）3．加入600微升补充液（Reagent C）4．加入200微升反应液（Reagent A）5．轻轻上下倾倒比色杯，混匀反应物6．室温下暗室里孵育5分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以200微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）三、玻璃管大量测定（注意：参见注意事项2）A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备好5毫升玻璃管3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到5毫升玻璃管2）分别加入适量的补充液（Reagent C）3）最后分别加入1毫升反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（毫克）1 4毫升0 1毫升 42 2.5毫升 1.5毫升1毫升 2.53 2毫升2毫升1毫升 24 1毫升3毫升1毫升 15 0.5毫升 3.5毫升1毫升0.56 0.25毫升 3.75毫升1毫升0.257 0 4毫升1毫升0 4．涡旋震荡，混匀反应物5．室温下暗室里孵育30分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质浓度（毫克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．移取250微升待测样品到5毫升玻璃管里30030.23．加入3.75毫升补充液（Reagent C ） 4．加入1毫升反应液（Reagent A ）5．涡旋震荡，混匀反应物 6．室温下暗室里孵育30分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以0.25毫升（样品量），获得待测样品的实际浓度（毫克/毫升）注意事项1． 本产品为200次（96孔板测定），100次操作（48孔板测定），50次操作（比色杯测定）包括标准曲线 2． 玻璃管大量测定须另购 Bradford 大量蛋白质浓度定量试剂盒（）3． 操作时，须戴手套4． 建议用户使用48孔板微量测定时样品和试剂的用量，以及在最后浓度计算时的除数 序号待测样品补充液（Reagent C ）反应液（Reagent A ）蛋白浓度计算的除数 1 5微升 395微升 100微升 5 2 50微升 350微升 100微升 50 3 100微升 300微升 100微升 100 4250微升 150微升 100微升250如果是96孔板测定：待测样品、补充液（Reagent C ）和反应液（Reagent A ）的用量是48孔板测定的二分之一如果是比色杯测定：待测样品、补充液（Reagent C ）和反应液（Reagent A ）的用量是48孔板测定的2倍 5． 样品浓度计算公式：标准曲线求得蛋白含量（微克）÷样品量（微升）＝微克/微升6． 加样后即刻比色测定7． 比色测定后，比色杯须清洗彻底 8． 强碱性样品将会干扰比色检测9． 下列化学成分和浓度范围不会干扰比色检测：Acetate0.6 M KCI1.0 M AcetoneMalic acid0.2 MAdenosine 1 mM MgCl 2 1.0 M Amino Acids Mercaptoethanol 1.0 M Ammonium sulfate 1.0 M MES 0.7 M Ampholytes Methanol 0.5％ AcidMOPS 0.2 M ATP 1 mM NaCl 5 M Barbital NAD 1 mM BES2.5 M NaSCN3 MBoric acidPeptonesCacodylate-Tris 0.1 M Phenol 5% CDTA 0.05 M Phosphate 1.0 MCitrate 0.05MM PIPES 0.5acid 1mM Deoxycholate 0.1% Polyadenylic（MW<3000）PolypeptidesMDithiothreitol 1M0.2mg/ml PyrophosphateDNA 1mg/ml EDTA 0.1M rRNA 0.25mg/mlM tRNA 0.4 EGTA, 0.05mg/ml0.30RNAEthanol totalEagle’s MEM SDS 0.1%phosphatesolution SodiumsaltEarle’s20%sulfateacid 1.0M StreptomycinFormicX-100 0.1% FructoseTritonGlucose TricinemM Glutathione Tyrosine 1mMThymidine 1 Glycerol99%Glycine 0.1 M Tris 2.0 MGuanidine-HCI Urea 6 Msaltsolution VitaminsHank'sHEPES buffer 0.1 M10．建立微量测定的标准曲线，建议使用的蛋白质浓度范围为0至50微克11．本公司提供系列蛋白定量检测产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。

蛋白标准(5mg/ml BSA)
产品简介：
蛋白标准(5mg/ml BSA)是用于碧云天生产的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)的专用试剂。

同时也可以用作其它方法进行蛋白浓度测定时的蛋白标准。

保存条件：
-20ºC保存，一年有效。

注意事项：
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用本产品的文献：
1.Zhao Y, Liu H, Li Y, Wu J, Greenlee AR, Yang C, Jiang Y.
The role of miR-506 in transformed 16HBE cells induced by anti-benzo[a]pyrene-trans-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide.
Toxicol Lett. 2011 Sep 10;205(3):320-6.
2.Duan J, Zhang Q, Zhao H, Du J, Bai F, Bai G.
Cloning, expression, characterization and application of atcA, atcB and atcC from Pseudomonassp. for the production of L-cysteine.
Biotechnol Lett. 2012 Jun;34(6):1101-6.
Version 2015.9.8。

Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明货号：PC0010规格：2500T保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。

产品内容：组成包装（2500微孔)保存5×G250染色液100ml2-8℃PBS稀释液30ml2-8℃蛋白标准(5mg/ml BSA)1ml-20℃产品简介：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。

Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween20,60,80低于0.06%。

操作说明：一．微孔酶标仪法1.完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul，使终浓度为0.2mg/ml。

待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。

2.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。

4.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。

由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。

5.各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。

6.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。

Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒 Bradford Protein Assay Kit产品编号：C503031包装规格：200 Assays/1000 Assays+10 Microplates 产品简介Bradford 试剂蛋白定量是一种快速，即用型的总量蛋白光学定量方法，在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm ，同时颜色也由棕色变为蓝色，该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。

将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford 试剂混合，测量在595 nm 处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA 建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。

产品特点 1. 检测速度快，10~20个样品只需不足10 min 即可完成。

2. 灵敏度高，最小检测蛋白量达到0.2 μg ，待测样品体积1~20 μL 。

3. 在10~150 μg/mL 浓度范围内有较好的线性关系。

4.与还原性糖和还原性巯基试剂兼容。

运输和保存条件常温下运输，收到后，将Bradford 试剂和PBS 在2~8°C 环境中保存，5 mg/ml 蛋白质标准液-20°C 保存，保质期两年。

试剂盒组成 组分 C503031 Bradford 试剂200 mL BSA 标准蛋白 5 mg/mL 1 mL1×PBS 10 mL操作步骤A 试剂准备1. 取一定量的BSA 蛋白质标准液(5 mg/ml )，用1X PBS 稀释为终浓度为200 μg/ml 。

2. 将样品用1X PBS 做适当倍数的稀释。

B. 分光光度法 1.取20支1.5 mL 离心管，分为标准组和样品组。

其中16支1.5 mL 离心管，每个标准品设置1个重复，各管分别加入100 μL 相应浓度的标准蛋白质溶液(200 μg/mL)；剩余4支1.5 mL 离心管，分为2个重复组，重复组离心管编号相同。

考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒 M2031 产品说明书考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit产品简介：Bradford法（考马斯亮蓝法），是目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一。

当Bradford 染色液（考马斯亮蓝G250）和蛋白在酸性条件下结合时，溶液颜色由棕黑色转为蓝色，最大吸光值波长由456nm 转至595nm，吸光值与蛋白质的含量在一定浓度范围内有较好的线性关系，通过测定吸光值大小并对照标准蛋白的吸光值，推算出蛋白浓度，实现了蛋白浓度测定的快速，稳定和高灵敏度。

Bradford 染色液为2 倍浓缩母液，便于储存。

产品特点:●快速，10-20 个样品只需要10 分钟即可完成测定。

●稳定，加样混匀后2 分钟既可测定，1 小时内吸光度变化不超过10%。

●最小测量体积为1-20 uL，最低测量蛋白量为0.5 ug。

●有常规和微量两种检测模式。

●不受绝大部分样品中的化学物质的影响。

巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5 mM。

●但受略高浓度的表面活性剂影响，各种蛋白质与染料的结合效率可能有差异。

●经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。

产品组成：上海美季生物技术有限公司上海市中山南二路777号2号搂2303考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒 M2031 产品说明书保存温度：Bradford染色液2-8℃保存，BSA蛋白标准-20℃保存。

有效期一年。

操作步骤：一、常规测定A．96 孔酶标板测定：1.根据需要从冰箱取出适量Bradford 2x 染色液，平衡至室温并混匀；预热酶标仪20分钟。

2.根据需要取适量标准品,加入去离子水稀释至1mg/ml(原液5mg/ml),并混匀。

注意：原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但是为了简便起见，也可以用去离子水、0.9%NaCl或PBS稀释标准品。