沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【摘要】为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法.该方法的敏感性可达100 fg DNA,高于常规PCR方法100倍；全部反应可在1h内完成；可通过肉眼观察颜色直接判定结果；对其他常见病原体的检测结果均为阴性.结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)005【总页数】4页(P27-30)【关键词】肠炎沙门菌;环介导等温扩增;检测【作者】邓显文;谢芝勋;谢丽基;谢志勤;刘加波;庞耀珊;彭宜;范晴【作者单位】广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.612肠炎沙门菌是目前引起人类食物中毒的主要病原之一，其感染主要是因食用了被肠炎沙门菌污染的动物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，近年来，肠炎沙门菌食物中毒和动物感染肠炎沙门菌十分严重，已引起养殖业和公共卫生界的高度重视［1－4］。

目前应用PCR技术对SE的检测已有报道［5－9］，PCR检测方法虽然快速、敏感性较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂等，环介导等温扩增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，该技术具有简捷、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛应用［10－11］。

沙门氏菌invA基因ICAN快速检测法的研究嵌合引物介导的恒温扩增（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，ICAN）反应需要三个特殊的组成：5’-DNA-RNA-3’的嵌合引物、耐热的RNaseH及具有链取代活性的DNA聚合酶，此法只需在55℃左右恒温反应一个小时即可[1]。

本文阐述了为建立快速检测沙门氏菌invA基因的ICAN法进行的研究，结果没有出现如报道中描述的清晰的三条带，但是与阴性和其他肠杆菌科细菌相比，沙门菌有明显的特异性条带。

本文对出现此结果的原因进行了比较详尽的分析。

标签：沙门氏菌；ICAN；invA基因沙门氏菌（Salmonella）为肠杆菌科沙门氏菌属成员，是一类条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌。

绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物多种不同的临床表现，主要引起发热、胃肠炎、腹泻和败血症等，中毒严重的，可引起死亡，病死率一般是0.5%～1%[2，3]。

据世界卫生组织的报道，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，给各国经济造成重大损失。

因而，在医学和公共卫生上具有非常重要的意义。

目前，对沙门氏菌检测大多采用细菌分离、生化鉴定、PCR等方法，过程烦琐、费时费力，并且肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，因此，这些检测方法在快速、敏感与特异性等方面有自身的局限性[4～6]。

Cocolin等[7]利用PCR扩增invA 基因快速检测食品中的沙门氏菌；Bohaychuk[8]等人利用荧光定量PCR技术对沙门氏菌invA基因进行定量检测。

随着对分子生物学技术研究的不断进展，2007年日本学者Hiroyuki Mukai[1]等发明了一种嵌合引物介导的恒温扩增法（即ICAN法）。

ICAN反应在恒温条件下进行，5’-DNA-RNA-3’的嵌合引物、耐热的RNaseH及具有链取代活性的DNA 聚合酶是ICAN反应必需的。

食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立黄金海;孙跃辉;陈瑞;庄世文;刘莹;王静思【摘要】It is important to detect Salmonella in food or food materials in order to assure the food safety. A rapid sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method assay for the food-borne pathogen Salmonella detection was developed. A set of primers were designed according to the nucleotide sequence of the target invA gene in Salmonella, 7 strains of Salmonella and 4 non--Salmonella bacteria were detected by LAMP, and meanwhile the mode of artificially contaminated food was constructed to evaluate the sensitivity of LAMP assay and bacterial cell counting method. The results showed that all the 7 Salmonella bacterial strains had specific amplification, but the 4 non-Salmonella bacterial strains submitted negative reactions. Sensitivity of LAMP assay for pure cell culture of Salmonella was 336 mL-1. However, an 8.25 g-1 detection limit was obtained for Salmonella artificially contaminated food following a bacterial culture enrichment process, while there was no amplification from the negative control. In conclusion, the LAMP assay developed in the present study is a specific, sensitive, simple and convenient method for the rapid detection of Salmonella in contaminated foods.%食品及其原料中沙门氏茵的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏茵invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术(LAMP),分别对7种不同血清型沙门氏茵和4种非沙门氏茵进行扩增,同时建立沙门氏茵人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活茵计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25g-1.所建立的检测沙门氏茵方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏茵污染食品的快速检测.【期刊名称】《天津大学学报》【年(卷),期】2012(045)005【总页数】5页(P468-472)【关键词】沙门氏菌;侵袭性因子A;环介导等温扩增技术【作者】黄金海;孙跃辉;陈瑞;庄世文;刘莹;王静思【作者单位】天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;华南农业大学动物医学院,广州510642;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072【正文语种】中文【中图分类】R155.5沙门氏菌是肠杆菌科中一大类重要的食源性致病菌，沙门氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位．WHO食源性疾病监控计划显示，欧洲每年约有160,000人感染沙门氏菌，大约每 100,000人中有 35人感染[1]，每年用于沙门氏菌的防控和治疗费用高达28亿欧元[2]．在我国，70%～80%细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起，引起沙门氏菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品[3]．沙门氏菌感染畜禽后可引发一系列疾病，在动物屠宰过程中，肠道中的致病菌会污染屠宰环境或被带到内脏与体表，成为畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源[4-5]．卫生检测要求中，世界各国普遍规定食品中不得检出沙门氏菌．沙门氏菌传统的检测方法大多采用细菌分离、生化鉴定表型方法、基于抗体的免疫学方法等，在快速、敏感与特异性等方面有局限性[6]．PCR法需要昂贵的循环仪，不适于基层快速检测．环介导等温扩增技术(loop-mediate isothermal amplification，LAMP)是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于识别靶 DNA上6个特定区域的4条引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，反应结果可通过肉眼观察，具有高特异性、快速灵敏、操作简单等特点．自 2000年该技术开发以来，LAMP技术在临床疾病的诊断、流行性细菌以及病毒的检测等方面应用广泛[7-9]．笔者针对沙门氏菌侵袭性因子 A基因(invA)设计一套 LAMP引物，对 7种血清型的沙门氏菌进行检测，优化反应条件，验证其特异性和灵敏度，并应用于食品的检测，建立了沙门氏菌检测方法．1 材料与方法1.1 菌株菌株名称及编号见表 1，本实验室分离、鉴定和保存．表1 实验用菌株Tab.1 Bacterial strains used in the experiment菌名中文名菌株Salmonella typhimurium 鼠伤寒沙门氏菌 JS1 Salmonella amsterdam 阿姆斯特丹沙门氏菌 JS2 Salmonella pullorum 鸡白痢沙门氏菌 JS3 Salmonella enteritidis 肠炎沙门氏菌 JS4 Salmonella newport 纽波特沙门氏菌 JS5 Salmonella paratyphi A 甲型副伤寒沙门氏菌 JS6 Salmonella choleraesuis 猪霍乱沙门氏菌 JS7 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌PYN1 Streptococcus suis 猪链球菌 SC1 Campylobacter jejuni 空肠弯曲菌CJ22 Escherichia coli 大肠杆菌 ATCC 27,1551.2 主要试剂和仪器细菌基因组 DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA-LAMP扩增试剂盒(荣岩化学株式会社，日本)，LA-320CE实时浊度仪(荣岩化学株式会社，日本)．1.3 方法1.3.1 DNA模板的制备(1) 试剂盒法：按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA．(2) 煮沸法：细菌纯培养物 1,mL于12,000,r/min离心 5,min，加入100,µL 无菌水，混匀后，煮沸10,min，冰浴2,min，12,000,r/min离心5,min，上清液备用．1.3.2 引物设计与合成根据GenBank公布的沙门氏菌 invA基因(登录号：EU348365)中保守序列，设计一套特异性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3，2条内引物 FIP、BIP和2条环引物LF、BF．引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表2．1.3.3 LAMP反应和结果判定图1 LAMP引物设计示意Fig.1 Schematic representation of LAMP primer design表2 扩增invA基因的LAMP引物序列Tab.2 DNA oligonucleotide primer Sequence of LAMP for the invA gene名称引物序列F3 5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’B3 5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’LF5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’BF 5’-AAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’FIP 5’-GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG-3’BIP 5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3’反应体系包括反应缓冲液12.5,µL，Bst DNA 聚合酶1.0,µL，DNA 模板2.0,µL，外引物 F3、B3 各5,pmol，内引物 FIP、BIP 各 40,pmol，环引物 LF、BF各20,pmol，最后加入去离子水至总体积为25,µL．混匀后，置于LA-320CE浊度仪，于63,℃温浴60,min，80,℃灭活 2,min．反应过程中，LA-320CE浊度仪对反应体系的浊度进行实时测量，每 6,s检测一次体系在 650,nm处的吸光度，生成浊度变化曲线，当反应体系浊度超过0.25以及浊度的变化速率大于0.1时，结果判定为阳性．也可通过肉眼观察反应体系的浊度变化判定结果．1.3.4 特异性实验用建立的 LAMP方法，分别对 7种不同血清型的沙门氏实验菌株进行检测，同时以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌和空肠弯曲菌作对照，验证方法的特异性．1.3.5 灵敏度试验基因组 DNA检测灵敏度：用试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌(JS1)基因组 DNA并测定其浓度，10倍倍比稀释，DNA 原液至 10-1～10-7(体积分数，下同)，各取2,µL 作为模板进行LAMP反应．细菌纯培养物检测灵敏度：将培养过夜的鼠伤寒沙门氏菌(JS1)菌液 10倍倍比稀释至 10-1～10-6，取各稀释度菌液100,µL 进行平板菌落计数，每组设 3个重复．同时，取各稀释菌液 1,mL，用煮沸法提取DNA，取2,µL上清液作为模板进行 LAMP扩增，利用LA-320CE对扩增结果进行实时检测．1.3.6 食品样品检测取细菌培养、常规 PCR沙门氏菌检测阴性的猪肉 10,g，无菌操作置于匀浆机并加入 90,mL 缓冲蛋白胨水(BP)，制备1∶10稀释的均质液备用．取10,mL猪肉匀浆液，接入已知浓度的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株(JS1)，混匀后作为食品样品原样，之后以匀浆液为稀释液10倍倍比稀释，37,℃培养12,h后，各取1,mL用煮沸法提取DNA，进行LAMP扩增．2 结果2.1 沙门氏菌LAMP检测方法的建立以设计的一套特异性引物对沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组DNA进行LAMP扩增，检测结果见图2．由图 2(a)可知，以沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组DNA 为模板的扩增通道，吸光度大于 0.5，判断为阳性，而以水为阴性对照的通道未出现扩增；由图2,(b)判定曲线可知，当扩增反应进行到 16,min左右时，通道1浊度的变化速率为0.104，判为阳性．结果表明该引物能够有效地扩增沙门氏菌 invA基因，检测时间约为16,min．图2 沙门氏菌标准菌株LAMP检测结果Fig.2 LAMP results of Salmonella standard strain2.2 特异性实验特异性实验结果如图3所示，仅7株沙门氏菌出现LAMP扩增，检测结果为阳性，其他4种菌均无扩增值，检测结果为阴性，表明该引物特异性强．图3 沙门氏菌LAMP特异性实验结果Fig.3 Specificity of Salmonella LAMP assay2.3 灵敏度实验2.3.1 基因组DNA检测灵敏度沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组 DNA浓度为45,ng/µL．10倍倍比稀释DNA原液进行LAMP检测，结果显示基因组DNA检测限约为900,fg，见图4．图4 沙门氏菌基因DNA LAMP检测灵敏度Fig.4 Sensitivity of Salmonella genomic DNA LAMP assay2.3.2 细菌培养物检测灵敏度经平板计数，原始菌液浓度为3.36×106,mL-1.10倍倍比稀释菌液进行 LAMP检测，结果该法细菌纯培养物检测限约为3.36×106,mL-1，见图5．2.3.3 食品样品中沙门氏菌的检测采用无菌的猪肉匀浆构建食品样品模型，加入已知浓度的沙门氏菌培养液，构建人工感染的食品原样模型，使得食品原样模型中沙门氏菌浓度为8.25×103,mL-1，亦即模拟食品原样中沙门氏菌的浓度为8.25×104,g-1．通道 1为猪肉匀浆中加入已知浓度沙门氏菌培养液作为食品原样，通道2～通道5分别为食品原样的 10倍梯度稀释，作为食品样品，提取DNA进行 LAMP检测，通道 8为无菌的猪肉匀浆．结果见图 6，通道 1～4均出现明显的扩增，通道5和通道8无扩增，结果表明该法直接检测食品样品的检测限为8.25,g-1．图5 沙门氏菌细菌培养物LAMP检测灵敏度Fig.5 Sensitivity of Salmonella LAMP assay图6 模拟食品样品中沙门氏菌LAMP检测灵敏度Fig.6 Sensitivity of Salmonella LAMP assay in artificially contaminated food3 讨论沙门氏菌是一种人畜共患的病原菌，能引起人和动物多重共患病，而食源性沙门氏菌污染检测主要还是传统的培养法，费时费力，不利于在沙门氏菌暴发流行时准确、快速地确定传染源和传染途径，控制其流行．PCR方法敏感、准确、快速，目前已广泛用于食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌的检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层应用．LAMP依赖于能识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效性，在反应过程中核酸大量合成，从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结合，产生扩增反应副产物-焦磷酸镁白色沉淀，反应体系浊度发生变化，肉眼可见[10]，不需要昂贵的仪器，只需要一个恒温的水浴即可实现检测，操作简单，便于现场快速检测和基层应用．也可以通过 LA-320CE实时浊度仪进行实时反应及终产物的一步检测．引物设计对于建立 LAMP方法非常重要，是检测沙门氏菌成功与否的关键．用来设计引物的基因主要分 3类，即属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因．沙门氏菌的inv基因族具有属特异性，inv基因族包括 invA、invB、invC、invD和invE等一组系列基因，它们在沙门氏菌中广泛分布，而invA基因编码的蛋白在细菌的致病过程中起着重要的作用[6,11]．对沙门氏菌invA 基因序列分析表明，沙门氏菌属的不同沙门氏菌菌株的invA基因核苷酸序列存在较高的同源性，BLAST检索与其他生物无同源关系，因此，invA基因是沙门氏菌的主要特征区域，常作为基因检测和鉴定的依据[12]．本研究选择与食品安全和公共卫生密切相关的肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌等为研究对象，选择 invA基因设计引物，对 7种不同血清型的沙门氏菌都能有效扩增，而非沙门氏菌不扩增，说明设计的引物对具有沙门氏菌属特异性，可用于沙门氏菌的检测．与沙门氏菌培养物相比，食品中沙门氏菌的检测具有更大的难度．直接用 LAMP检测食品中的沙门氏菌面临的一个问题是不能将活菌和死菌区别开来．由于检测的灵敏性高，即使是样品中存在死亡沙门氏菌的 DNA也会产生阳性结果，但死亡沙门氏菌的存在对食品安全并不构成威胁，所以建立能够区分死菌和活菌的方法对沙门氏菌检测较为重要．为此，在LAMP检测之前，需要选择性增菌，以减少来自样品中死亡沙门氏菌的 DNA的影响，从而增加了检测方法对样品生物安全评估的可信度，同时也提高了食品中沙门氏菌的检出率．应用建立的LAMP方法，液体样品中沙门氏菌检出下限为 336,mL-1，而常规PCR 的检出线一般在 103～105,mL-1活菌水平[13]．应用建立的LAMP方法，经增菌培养程序后，可检出含菌量为8.25,g-1的阳性肉品．应用LAMP方法对沙门氏菌进行检测，从检测结果来看，方法特异、敏感，可有效检测样品中的沙门氏菌；检验周期短，每一批样品从样品准备到检出只需要2,h，如果将增菌时间计算在内，也仅需要15,h；操作简单，检测成本低，不需要昂贵的检测设备，检测结果肉眼可见，可适应国境口岸方便快捷的需要，在基层检测中易于推广，具有较高的实用价值．4 结语应用所建立的 LAMP方法检测沙门氏菌 invA基因，在检出时间、灵敏度方面优于其他血清学及PCR方法，通过富集增殖后进一步提高了灵敏度和检出率，降低了复杂食品原料对检出率的影响，LAMP方法还可通过眼观进行判定，适用于基础应用．沙门氏菌 invA基因检测的 LAMP方法，可作为动物沙门氏菌感染、进出口检疫、食品及其原料中沙门氏菌污染快速检测及其安全性评价的手段．【相关文献】［1］ Anonymous. 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2009年第35卷第3期(总第255期)137　原位荧光LAMP 技术检测食源性沙门氏菌3叶宇鑫,李琳,山崎伸二,石磊(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州,510640)摘　要　以沙门氏杆菌为研究对象,探讨了将原位荧光L AMP 技术应用于检测沙门氏菌所需要的具体实验方法与数据,并成功将原位荧光L AMP 技术应用于检测人工污染的食品中的沙门氏菌。

实验选取invA 基因作为靶序列设计了2对引物。

结果证明,与传统沙门氏菌检测方法和PCR 方法相比,原位荧光L AMP 无需破碎细胞提DNA ,反应方便易行,耗时少;反应条件恒定温和,能够减少细胞损伤;单基因检测水平证明反应的高灵敏度;良好的基因定位以及清晰的背景条件使反应结果更加直观,易于观察。

关键词　原位荧光L AMP ,沙门氏菌,检测第一作者:硕士研究生(石磊教授为通讯作者)。

　3国家自然科学基金项目(20877028)收稿日期:2008-11-05,改回日期:2008-12-10 食品安全是各国都关注的重大问题,食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一,检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节[1]。

沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要菌属,是人和动物的常见病原菌,可引起人类多种疾病,如食物中毒、胃肠炎、菌血症、肠热症等。

据统计,目前世界上85%的食物中毒是由沙门氏菌引起的[2]。

虽然传统的沙门氏菌检测方法本身证明是可靠的,但却很费力、耗时,需要4～7d 才能完成,已不能达到令人满意的效果[3]。

目前,PCR 是应用的比较广泛的快速检测法。

然而,PCR 虽然能扩增各种标本的DNA ,但扩增的DNA 或RNA 产物不能在组织细胞中定位,这是该技术一个局限性。

原位杂交虽然具有良好的定位能力,但由于其敏感性问题,尚不能检测出细胞内的单拷贝基因[6,7]。

原位PCR (In Sit u PCR )结合了原位杂交和PCR 技术,可使扩增的特定DNA 片段在分离细胞和组织切片中定位,从而弥补PCR 和原位杂交的不足。

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。

选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。

通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。

用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。

关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。

该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。

许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。

常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。

有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。

另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。

因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。

为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。

随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。

PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。

沙门氏菌快速检测技术研究进展摘要：沙门氏菌是食品中最常见的致病菌，是导致食物中毒的重要病原菌之一，严重危害人类的健康安全和食品安全。

传统的细菌学检测耗时繁琐，不能满足当今发展的需求。

本文简要介绍了近年来沙门氏菌快速检测技术研究进展，并分析各种检测方法的优缺点，以期寻找一种快速、简便、特异、灵敏，能检测绝大多数血清型沙门氏菌的方法。

关键词：沙门氏菌；快速检测、免疫学技术、分子生物学技术Research Progress on the Rapid Detection of SalmonellaZhao Hui(College of Food Science and Engineering , Northwest A&F University , Yangling, Shaanxi 712100, China) Abstract：Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about hazard on human , The traditional bacteriology detections have not bee satisfied the requirement of development because of time -consuming. This review briefly introduced research progress of the rapid detection of Salmonella in recent years and analyzed the advantages and disadvantages of various detection methods，hoping to find a fast，simple，specific and sensitive method that could detect the majority serotypes of Salmonella．Keywords:salmonella；rapid detection；immunological techniques；molecular biological techniques随着国民经济的发展，食品、海产品中存在的卫生隐患问题愈发严重，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2 位，在中国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40% -60%[1]。

LAMP方法及其在病原微生物检测中的应用吴禹熹;李璞君;王娟;杨发龙【摘要】环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一门新兴的分子生物学技术,该技术具有操作简单、不需要大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单等优点,且具有比常规分子生物学方法更高的灵敏度和特异性.目前该技术在细菌、病毒及支原体等病原微生物的快速检测和早期诊断中已广泛应用.通过对国内外LAMP研究进展及该技术在细菌、病毒、支原体等致病菌中的诊断应用进行综述,以期介绍该技术的优缺点和应用现状,从而为今后的广泛应用提供参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)002【总页数】5页(P389-393)【关键词】环介导等温扩增技术;致病菌;检测【作者】吴禹熹;李璞君;王娟;杨发龙【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】S852.61分子生物学技术，特别是PCR，目前作为一种常用且高效的核酸扩增技术，在传染病诊断和病原的检测中发挥了重要的作用。

但PCR扩增结果必须通过电泳才能观察到，不适用于现场检测病原微生物。

因此，开发一种简易快捷、特异、灵敏的核酸扩增检测方法成为当务之急[1]。

2000年，由Notomi等[2]首先发布了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。

LAMP作为一种快速准确且敏感度高的诊断方法备受瞩目。

LAMP是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和2对特殊引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65 ℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。

动物饲料中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速诊断方法的建立孙园园;赵鹏【摘要】According to the highly conserved fimY gene of Salmonella, reported in the GenBank. By primer explorer V4 softward, one set primer including four primers ,were designed and the method for detecting the Salmonella with LAMP was developed after optimizing the reaction conditions. The results showed that the detection limit of the LAMP assay was 6. 2 CFU/mL which was 100-fold higher than that of PCR. The test results of 24 samples by LAMP method was fully consistent with these by the national standard method. The results showed the LAMP method is more reliable and convenient for rapid, sensitive and specific diagnosis of Salmonella.%根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法.结果表明,该方法具有较强的特异性；比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2 CFU/mL；对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致.证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)001【总页数】5页(P32-36)【关键词】沙门氏菌;饲料;环介导等温扩增;快速诊断【作者】孙园园;赵鹏【作者单位】镇江出入境检验检疫局,江苏镇江212008;镇江出入境检验检疫局,江苏镇江212008【正文语种】中文【中图分类】S852.61沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位（蔡宝祥，2004）。

LAMP检测沙门氏菌方法的建立作者：洪艳贺凡王晓闻来源：《山西农业科学》 2015年第4期洪艳1，贺凡2，王晓闻2（1.山西农业大学文理学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）摘要：环介导等温扩增（LAMP）是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。

研究选取沙门氏菌编码DNA 解旋酶B亚单位的gyrB 基因设计了1套引物，总反应体系25 μL，63 ℃恒温1 h，用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性，而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性；LAMP的灵敏度为6.8×101 cfu/mL。

LAMP检测方法更快速、灵敏，有着较为广泛的发展前景。

关键词：沙门氏菌；LAMP；灵敏度；特异性中图分类号：R155.5文献标识码：A文章编号：1002-2481（2014）04-0340-03收稿日期：2014-01-20作者简介：洪艳（1983-），女，浙江绍兴人，助理实验师，硕士，主要从事生物化学研究工作。

王晓闻为通讯作者。

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一[1]。

人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，进行了不懈的努力，建立了一定的快速检验方法[2-5]。

Notomi等[6]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification），该方法不需要模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。

LAMP是一种崭新的DNA扩增方法，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强和时间短的特点，具有替代PCR方法的可能性[7-10]，本研究建立了LAMP检测沙门氏菌的检测方法。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella cholerae-suis）、山夫登堡山沙门氏菌（Salmonella calabar）、曼哈登沙门氏菌（Salmonella manhattan）、鸡沙门氏菌（Salmonella gallinarum533）、甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）、链球菌（Streptococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（E. coli O216）。