质粒提取试剂盒 (2)

质粒的大量提取

质粒大量提取的主要试剂

溶菌酶（10 mg/ml）：100 μl 1 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 g 溶菌酶，加超纯水至10 ml，混匀，可根据用量分装至小管，置于-20 ℃保存。

1×TE（pH 8.0）：5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），1 ml 0.5 M EDTA，加超纯水定容至500 ml，湿热灭菌，室温保存。

RNaseA（10 mg/ml）：0.1 g RNaseA，33 μl 3 M NaAc（pH 5.2），加超纯水至9 ml，100 ℃，15 min，冷却至室温，置于-20 ℃保存。

25％ 蔗糖：25 g 蔗糖，5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。

0.5 M EDTA：186.1 g EDTANa2H2O，NaOH约20 g，加800 ml超纯水溶解完全后，调pH至7.6，定容至1 L，湿热灭菌，室温保存。

Triton-lysis：1 ml 10% Triton-100，12 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，室温保存。

PEG8000：150 g PEG8000，150 ml 5 M NaCl，加超纯水定容至500 ml，常温保存。

EB（10 mg/ml）：10 mg EB，加超纯水1 ml，溶解，室温保存。

质粒大量提取的步骤（CsCl超速离心纯化DNA）

A. 取1 ml含目的质粒的菌液，接种到400 ml含80 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃摇床上剧烈振荡（200 rpm）培养12 h左右。

B. 将菌液倒入离心瓶，4200 rpm离心13 min；弃上清，菌体沉淀用6 ml含25％ 蔗糖的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液重悬。

实验 2 大肠杆菌质粒DNA的提取

1.实验目的

学习提取质粒DNA的方法，并掌握提取质粒DNA的原理。

2.实验材料、主要仪器及试剂

材料：

pUC系列质粒

主要仪器：

超净工作台、低温离心机、恒温水浴锅、微量移液器、培养箱、摇床、紫外观测仪和琼脂糖凝胶电泳系统等。

主要试剂：

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L Tris·HCl（pH8.0）

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

灭菌后4℃保存

（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（现用现配）

1% SDS（pH值12.6）

（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml

冰乙酸 11.5ml

水28.5ml（pH4.8）

（5）LB培养基

4.质粒DNA提取与回收

（1）菌体的培养与收集

从LB平板上挑细菌单菌落，接种于5ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，37℃250r/min，过夜培养，用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的OD620=0.2～0.6时为对数期的菌液。也可取1/100的过夜菌液，继续摇瓶培养2.5h，此时菌液达对数期。

取1.2ml菌液，5000r/min 4℃离心10min，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用STE或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集细菌后可选择以下方法提取质粒。

（2）质粒DNA的提取（碱裂解法）

①将收集的细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中，强烈振荡混匀；

②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上放置3min

③加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上5～10min。

④12 000r/min离心10min，取上清。用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。

质粒提取试剂盒说明书

而载体构建的方法有多种：

常规克隆（分子克隆你不知道的那些事）

TA克隆（这么简单的TA克隆来领走吧）

同源重组（秒杀分子克隆！同源重组快人一步）

而经转化（DH5α感受态制备及转化）、菌落PCR（菌落PCR）验证得到阳性克隆后，就需要提取质粒了。构载体是分子生物学中最基本的实验了，而提质粒可以说是最简单的实验了，完全不经过大脑，照着说明书就是“机械”操作，因为这个有现成的试剂盒嘛。

嗯，虽然简单，但是也不能不想啊，要不然提质粒是按什么原理来的你都不知道，这不，当你还在傻傻用试剂盒提质粒的时候，我已经开始自己配buffer了。

加灭菌水补足到1 L。

这个溶液的主要作用是细胞裂解，氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，同时会使基因组变性成单链，而对质粒无影响。在这一步，试剂盒的说明书上会说时间不能过长，因为时间长了对质粒也是有影响的。而SDS可以和蛋白结合，使变性蛋白质将溶解在溶液中，从而多肽链更好地与基因组DNA缠绕。这个溶液一看就是酸，用来中和碱的，同时还能清除掉蛋白质等细胞内的杂质，此时基因组也会复性沉淀下来。另外醋酸钾会与Solution Ⅱ中的SDS发生作用，反应生成的十二烷基硫酸钾，而十二烷基硫酸钾不溶于水，会迅速发生沉淀，也就是我们提质粒时经常看到的沉淀。

好了，到这一步后，试剂盒法一般是要先离心，取上清去过柱，有的剂盒有一个柱的平衡液：

质粒提取试剂盒说明书

质粒提取的质量和得率受多种因素影响，既和质粒本身的性质以及拷贝有关，也和菌液的状态及实验操作有关，因此在质粒提取中的一些实验要点显得就极为重要了。质粒提取这看似简单的实验，却暗藏杀机，下面我们来看一下在质粒提取过程中那些习以为常的实验操作中的“误会“。

通常我们会认为越多的菌液或是越浓的菌液提取的质粒会越多，但实际实验中结果并非如此。

良好菌液的标准：

按1：1000的比例将菌液接种至培养基中，摇菌时间在8-12个小时，不超过16个小时。

菌液均匀悬浮于培养基中，无凝块、无沉淀，菌液的OD600吸光值在0.8-1.0之间，不超过1.2。

在提取质粒后进行凝胶电泳，如果在在超螺旋质粒的下方出现弥散条带，则是由于忘记加入RNaseA或RNaseA消化不充分，不完全降解的RNA与质粒共同被提取出来。

加入RNaseA的两个阶段：

在使用试剂盒提取质粒时，菌液重悬时在P1溶液中加入RNaseA

提取质粒后，在质粒溶液中加入RNaseA（试剂盒或溶液法）

RNaseA的使用方法：

RNaseA在质粒中的使用终浓度为20μg/ml

经RNaseA孵育的质粒，需要进行纯化去除残留的RNaseA

如何判断我们所使用的菌体量是否合适呢？在裂解时经几次颠倒混匀后，裂解液仍然为浑浊状态，说明未被裂解的菌体仍然悬浮在裂解液中，而充分裂解的菌体，溶液于裂解液中，裂解液呈现为澄清，质粒充分释放。

质粒小提试剂盒适合1-5 ml菌体的提取

小提中量试剂盒适合5-15 ml菌液的提取

中量提取试剂盒适合50-100 ml菌液的提取

大量提取试剂盒适合100-200 ml菌液的提取

如果我们想要增加提取的菌体量，也要相应提高所加入的裂解液体积。