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瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染：外源⽚段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导⼊的裸露的载体整合⼊基因组的⼏率⾮常低，所以以染⾊体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂⽽⼀同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
⽽且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极⾼。
这就导致瞬时转染呈现⼀个⾼拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且⽆法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染⽽⾔，进⼊细胞的质粒整合⼊细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是⼀种与瞬时转染不同的⽅法，只是对瞬时转染的细胞进⾏筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的⼏率因基因传递的⽅法⽽异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染⽅法，⽐如化学试剂介导的转染，其整合⼏乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递⽅法，呈现不同的靶向倾向性，所以是⼀种半随机整合。
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
cho细胞优化蛋白表达的方式Cho细胞是一种常用的宿主细胞，被广泛应用于蛋白表达领域。
Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括以下几个方面：选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。
在Cho细胞中进行蛋白表达，需要选择适当的表达载体。
常见的表达载体包括质粒和病毒载体。
质粒载体通常用于转染Cho细胞，而病毒载体则可以通过感染Cho细胞来实现蛋白表达。
根据实验的需要，可以选择不同类型的载体，如pCDNA3.1、pLVX等。
优化启动子和信号序列也是提高蛋白表达效率的重要策略。
启动子是控制基因转录的序列，在Cho细胞中常用的启动子有CMV、EF1α等。
信号序列则是控制蛋白质转运和分泌的序列，可以选择合适的信号序列来提高蛋白表达的效率。
调节培养条件也是优化蛋白表达的重要手段之一。
Cho细胞的培养条件包括培养基的选择、培养温度、CO2浓度、培养时间等。
合理调节这些条件可以促进细胞的生长和蛋白表达。
此外，添加适当的营养物质和辅助因子，如氨基酸、维生素和抗生素等，也能提高蛋白表达的效率。
选择合适的转染方法也是Cho细胞优化蛋白表达的重要环节。
常用的转染方法包括瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染通过将表达载体导入Cho细胞，使细胞在一段时间内表达目标蛋白。
稳定转染则是将表达载体导入Cho细胞，并筛选出稳定表达目标蛋白的细胞株。
选择适当的转染方法可以提高蛋白表达的稳定性和效率。
利用辅助蛋白也是优化蛋白表达的一种策略。
辅助蛋白可以提高蛋白质的折叠和稳定性，从而增加蛋白表达的效率。
常见的辅助蛋白包括分泌辅助蛋白、折叠辅助蛋白等。
在表达目标蛋白时，可以选择适当的辅助蛋白来提高表达效果。
Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。
通过这些方式的综合应用，可以提高Cho细胞中蛋白表达的效率和稳定性，为后续的蛋白研究和应用奠定基础。
基因转染的名词解释基因转染是一种生物学技术，用于将外源基因导入到目标细胞中。
该技术广泛应用于生命科学研究和生物医学领域，为我们深入了解基因功能、疾病治疗和农作物改良等方面提供了重要手段。
本文将对基因转染的定义、方法和应用进行解释和探讨。
一、基因转染的定义基因转染是一种将外源DNA序列导入目标细胞并使其表达的过程。
通常情况下，外源DNA序列被插入到可导入细胞的载体中，通过各种转染方法引入目标细胞。
基因转染技术的核心在于导入外源DNA，使其能够被目标细胞识别、复制和表达。
二、基因转染的方法1. 瞬时转染瞬时转染是一种转染效果较短暂的方法，适用于对细胞的短期基因表达研究。
常用的瞬时转染方法包括离子穿孔、脂质体介导转染和电穿孔等。
这些方法通过短暂地破坏细胞膜，使外源DNA能够进入细胞，并在一段时间内进行表达。
2. 稳定转染稳定转染是指外源基因在细胞中得以稳定表达的转染方法。
这种方法通常采用载体的长期表达构建，如质粒或病毒载体，使外源基因在细胞的染色体中稳定地整合并表达。
稳定转染方法包括病毒介导转染和基因枪等。
三、基因转染的应用1. 基因功能研究基因转染技术广泛应用于基因功能研究，帮助科学家理解基因在生物体中的作用机制。
通过将特定基因导入目标细胞，并观察其表达是否导致特定现象的改变，可以揭示基因的功能和相互作用。
2. 疾病治疗基因转染技术在疾病治疗中具有潜力。
例如，在基因治疗中，病人的细胞可以被转染以表达特定的基因，从而产生受体蛋白、酶或激素等。
这种技术可以用于治疗遗传病、癌症和心血管疾病等。
3. 农作物改良基因转染技术在农作物改良中发挥着重要作用。
通过将外源基因导入农作物的基因组中，可以使作物表达特定的性状，如耐病性、抗虫性和抗旱性等。
这种技术旨在提高农作物的产量和质量，增加农产品的抗病能力。
四、基因转染的挑战与争议尽管基因转染技术在科学研究和应用中具有巨大潜力，但也面临一些挑战和争议。
其中之一是生物伦理问题。
稳定表达系统和瞬间表达系统的区别稳定表达系统和瞬间表达系统是按目的蛋白表达的时空差异来分的；瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。
瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。
大规模的瞬时表达技术是近年来的一个研究热点。
已有报道能放大到100L反应器中生产重组蛋白，产量可达1~10mg/L。
缺点是该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等，而且瞬时转染得到的蛋白质产物保存时间较短，只能持续数天或2周。
这是因为瞬时转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染色体相整合，当细胞复制后，诱导的性状消失。
稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。
缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。
有研究表明：把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。
另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。
CHO细胞的背景资料CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。
全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。
另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。
CHO细胞的培养基类型：1. 血清培养传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。
细胞转染步骤细胞转染是将外源分子如DNA，RNA导入真核细胞的技术。
它已成为一种研究基因表达调控，基因突变分析，蛋白质生产的常规方法，其应用范围越来越广。
细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染两大类：瞬时转染，外源基因进入受体细胞后，存在于游离载体上，不整合在细胞的染色体上。
此时，外源DNA仍然以附加的形式存在于细胞内，因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间（1-3天）内进行测定或分析，而且质粒的人工构想和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能。
其优点是快捷、简单，易于对结果进行分析，因此成为启动子功能分析的首选方法。
稳定转染，外源DNA整合到宿主细胞的染色体上。
由于外源基因被整合到细胞的染色体中，使得调控区能更精确的模拟正常功能，对随后的转录分析没有时间限制。
缺点是需要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度大，需要的周期较长。
转染的常见方法有：（一）物理介导法：电击法、显微注射法、基因枪法（二）化学介导法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、脂质体法（三）病毒介导法：腺病毒法、逆转录病毒法现在对于很多普通细胞系，常用的是瞬时转染方法中的脂质体法。
下面介绍下细胞转染的具体步骤：1.转染前准备：转染前一天，取生长状况良好的细胞，经胰酶消化成单个细胞后，计数。
根据实验需要，铺合适细胞量在板中，使第二天转染时的细胞密度达到80-90%。
2、细胞转染（1）在做转染实验前一般给细胞更换新鲜的完全培养基，并置于培养箱中继续培养。
最好是加入加血清但不含抗生素的培养基。
（2）准备几个无菌的1.5ml EP管，并做好标记。
一支EP管上标记DNA（即质粒的名字），一支EP管上标记lipofectamine2000。
（3）分别在两支EP管加入50微升的opti-MEM。
（4）在标记质粒的EP管里加入质粒，另一支EP管里加入脂质体。
（5）分别轻轻混匀，室温静置5min。
（6）再将含有质粒的opti-MEM培养基加入到含有脂质体的opti-MEM的培养基中。
稳定转染VS瞬时转染展开全文生物通报道：转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，是细胞和分子生物学研究的重要工具，可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。
不论是质粒、DNA还是各种RNA（mRNA、siRNA或microRNA），要将这些外源核酸转入细胞并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。
转染方法可分为物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。
上述方法都可以解决转染面临的主要挑战，即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。
物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥，使核酸插入。
而化学转染中，一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。
这些方法都可以实现转染，可谓条条大路通罗马，那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢？瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。
细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。
稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立，只不过需要一个重要的偶发过程：在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。
外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。
稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。
在建立上述稳定转染细胞系时，我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。
将这些选择性标记与基因共表达，我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞，同时剔除瞬时转染的细胞。
将外源基因与抗生素抗性基因共转染（如新霉素抗性基因neo）是一种常用方法，随后可用相应抗生素（如geneticin或G418）对转染后的细胞进行筛选。
只有稳定转染的细胞才会获得对抗生素的抗性，在长期培养中存活下来，由此实现对目标细胞的筛选和扩增。
孰优孰劣？选稳定转染还是瞬时转染呢？这要看我们打算进行长期研究还是短期实验。
瞬时转染一般持续几天，用瞬时转染研究基因表达，通常在转染后的24小时至96小时内收获细胞，其具体时间取决于细胞类型、载体构建等多种因素。
也正因如此，瞬时转染一般用于研究基因或基因产物的短期表达，基因敲除或RNA介导的基因沉默，以及进行蛋白质小规模合成。
瞬时转染mRNA比转染传统质粒DNA出结果更快，这是因为mRNA能够直接在核外表达，在一些系统中mRNA可以在转染后几分钟就得到表达。
相应的，在需要进行长期基因表达时就得进行稳定转染，例如大规模蛋白合成、长期药理学研究、基因治疗研究和长期遗传调控机制研究等等。
稳定转染与瞬时转染相比，时间更长也更费劲，所以不到迫不得已一般不被选用。
以往对需要正确折叠和翻译后修饰的重组蛋白进行大规模合成，只能使用稳定转染的细胞。
但近年来瞬时转染和细胞培养方法的进步改变了这一局面，经过改良之后人们已经可以通过对一些普遍使用的细胞系（如HEK293和CHO细胞）进行悬浮培养，来实现瞬时转染的大规模重组蛋白合成。
建立稳定表达的细胞系既麻烦又费劲，在合适的情况下选用瞬时表达可以省去不少精力。
当然，在新的一年中转染技术的新发展无疑会进一步改进瞬时转染和稳定转染技术，使人们能够更加有效的进行外源基因表达。
瞬转和稳转最大的区别在于，细胞中很多蛋白的功能是互补型的，稳转由于筛选时间过长，往往细胞为适应变化，会激活一些备用的互补机制，以弥补功能的缺陷，从而削弱一些表型；此外，即使有一些表型，往往不能分析是信号多个节点发生改变后的效应（时间长，很多基因都可能会相应变化），还是靶蛋白本身的效应；即到底是单一作用，还是多点变化后的整体效应。
瞬转由于时间较短，往往细胞还不能完全适应，相对容易反映一些表层变化，并非很多信号级联后的整体效应。
其次，某些功能非常重要的基因，诸如我研究的蛋白掌握真核生物75%基因的表达，稳转无法实现——致死，甚至其上的抑制蛋白KD也致死，对于这类基因，唯一能做的就是瞬转，当大部分靶蛋白被KD以后，少量的残余蛋白能够勉强维持生命但不能完全满足细胞生长的，这时候就会有细胞表型。
瞬转的弱点在于不能达到100%的效率，如果侵染效率不高，将很难获得有效的表型；若想进一步进行过表达或KD另外的基因等，基本无从下手。
而稳转可作为稳定的模型，进一步进行相关的实验。
所以，到底稳转还是瞬转需要根据实验的需要，但是通常会同步进行，因为还没开始怎么知道会不会出现互补、致死等等问题，如果不会且表型和瞬转类似，那又多了一个重要的实验模型，为后续实验提供方便。
此外，你可以考虑构建可诱导型稳定细胞系，这个工具针对致死或互补等的蛋白，效果非常好影响转染的因素要看你的目的，是做瞬时表达还是稳定表达，做稳定表达，为了更好的整合到细胞的基因组上，可将质粒线性化，选择好酶切位点。
不酶切直接筛选稳定表达也可以得到结果。
293转染效率还是较高的，一般不用稳定筛选。
瞬时转染完全可以，如果是要以后做长期研究，观察长时间的效应，就的考虑稳定转染转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。
但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。
细胞：分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。
贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞（如HEK，CHO），悬浮细胞（如HL 60，Jurkat）非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。
这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。
因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等）需要优化。
传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度（通常在一个实验室范围内）。
某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。
因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学（以及转染能力）性质也可能会有很大的差异。
一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
细胞数量（融合率）——只要培养基质（组织培养皿）尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。
对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制（接触抑制），但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。
营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。
细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。
报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。
培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。
各种污染都会导致产生错误的结果。
支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35％，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。
特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使非典型转染或转染效率偏低。
这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。
和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。
它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜；它们还对常用抗生素有抗药性。
所以必需进行支原体污染的常规筛查。
交叉污染如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。
如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。
和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。
如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
载体DNA一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。
确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。
在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。
载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。
转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。
载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。
制备产物中残余的污染物（如CsCl，内毒素）可能会影响转染效率。
载体构造（启动子／增强子／ORI）—转染体系通常用带有强病毒调节元件（如，RSV，CMV，和SV40）的对照载体进行优化和比较。
然而，病毒启动子／增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。
例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达 large T抗原（如，COS）；而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。
除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。
组织培养试剂一般原则：优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
基础培养基——培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。
有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。
配置时要使培养基务必避光保存；因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
胎牛血清——血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。
添加剂——某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。
CO2培养箱——细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值，细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异。
