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SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 36.33g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS配置量：200ml配制方法： 1.称取2g SDS。
2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。
注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。
30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。
丙烯酰胺58gN-N亚甲基双丙烯酰胺2g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%APS （W/V）组份浓度：10%（W/V）过硫酸铵配置量：1ml配制方法： 1.称取0.1g过硫酸铵。
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g，混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) ：Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3)：Tris 15.2g 甘氨酸94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵(AP)：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液，0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml，10%SDS 4 ml，β-巯基乙醇1ml，甘油2ml，1%溴芬蓝1ml，置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-Page10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g，(12H2O)Na2HPO4 2.9011g，(2H2O)NH2PO4 0.24g，加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml，5%(V/V)脱脂奶粉1.5g，0.02%叠氮钠0.006g，0.05% Tween-20 0.015g12. 漂洗液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml，ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
一、试剂配置：1、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris+48ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
2、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40ml水中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
3、胶配置：加入TEMED后，立即混匀即可灌胶。
4、封闭液：（含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g+TBST 100ml溶解后4℃保存。
使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
5、抗体:用TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。
二、SDS－PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer）5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。
1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L,pH值为8.3。
使用前,将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液(Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置,因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310％SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50—68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121。
4。
4度储存。
5 10% APS （Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1。
5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完.6 10×TBS (Tris-buffered saline）的配置加HCl调pH到7.6，室温储存.7TBST （Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液(loading buffer)的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。
8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6。
4ml,10%SDS 12。
8ml,巯基乙醇3。
2ml，0.05％溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用.按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×）10 5×Sample buffer (10ml）11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% （w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0。
Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。
Western Blot储备液配制：（1）30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺（Acr）+1g甲叉双丙烯酰胺（Methylene Bisacrylamide）,超纯水至100ml溶解后4度保存（2）10%SDS: SDS10g ，超纯水至 100ml，水浴50度溶解，室温保存（3）电泳液(5×）：Tris15.1g +甘氨酸94g+SDS 5g 超纯水至 1000ml，常温保存（3）转膜液(1×)：甘氨酸14.4g，Tris 3g，甲醇 150ml，超纯水至1000ml备注：配制 2 瓶，1 瓶保存在 4℃，转膜前 2 小时放在-20℃使其降温，另一瓶浸泡用（4）TBS(10×)：Tris 24.2g + Nacl 80.0g，超纯水至 1000ml ，浓盐酸10ml 调 PH 至7.6（5）TBST(1×)：10×TBS 100ml + 超纯水 900ml + 吐温-20 1ml ，室温保存（吐温-20比较粘稠，可把枪头剪掉，应缓慢吸取防止产生气泡）二、蛋白提取管子全部提前标记好，离心机提前开，实验步骤提前预备好（1）提前称量好20mg组织（18mg～22mg），放入研磨管，加入研磨珠（2）加入裂解液，裂解液：[RIPA ：PMSF=100:1]（3）每个研磨管加入250μL 裂解液，裂解液提前混匀再加入到研磨管中（4）组织匀浆机研磨30秒（注意配平）（5）研磨好后立即放到冰上，放置8min让裂解液充分裂解（6）4℃×13000rpm，20min离心（7）取上清液150ul，放入标记好的EP管中（8）将原样稀释60倍[取10ul样品+590ul的PBS],放入标记好EP管中三．蛋白定量（BCA试剂盒法）（1）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。
例如：取20ul 的25mg/ml蛋白标准，加入980ul稀释液（PBS）即可配制成0.5mg/ml蛋白标准，可以在-20℃长期保存（2）根据样品数量，按50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
'配制Western-Blot 所用相关试剂1. 30%聚丙烯酰胺100ml （RT or 4 °C 避光保存）29g 丙烯酰胺1g bis- 亚甲双丙烯酰胺2. 10%SDS 100ml RT10g SD4100ml ddH z O 加热搅拌溶解3. Buffers RT or 4 ° C1.5M Tris (pH: 8.8) 500ml ( 加Tris 90.855g)1.0M Tris (pH: 6.8) 250ml ( 加Tris 30.285g)4.10% 过硫酸胺（APS）4 °C 避光保质期一周0.1g APS — 1ml ddH2O5. Tris-Glycine (Running Buffer) 1L RT or 4 °C5 X 10 X 1 XddH 2O 800ml 800ml 800mlTris 15g 30g 3gGlycine 94g 188g 18.8g10 ％SDS 50ml 100ml 10ml(1g)加ddH2O—1000ml6. 10X Tris-Glycine for Transferring 1L RT or 4 °CTris : 30.26gGlycine: 144.1gddH 2O: 1L1 X Transferring buffer10 X Tris-Glycine 100ml ( 或Tris:3.026g Glycine:14.41g) Methanol 200mlddH 2O 700ml7. TBS (washing buffer) RT or 4 °C ( pH 7.6)20 X 10 X 1 XTris 48.4g 24.2g 2.42gNaCl 160g 80g 8gddH2O 1000ml 1000ml 1000ml8. Buffer A:用超纯水配制250ml储存在4° C冰箱中终浓度母液所需用量20 mM Hepes (pH 7.4)13(25ml : 25*10- *FW g)5ml2 mM EDTA 0.5M 3(5ml: 2.5*10 - *FW g)1ml 50 mM 卩-glycerophosphate FW : 306.12 3.8265g1 mM dithiothreitol 1M ( 已分装，存于20冰相最低层铝盒)0.25ml1 mM Na s VQ 1M (2ml: 0.368g )0.25ml1% Triton, 20 %( 70ml)12.5ml10% glycerol 25ml备注：已经配制为1M并储存于一20° C冰箱Na 3VO4 (sodiium orthovanadate ),原装粉剂RT保存，在李志华最左边的抽屉里B —glycerophosphate 粉剂在4° C冰箱李志华层托盘中9. Protein in hibitors (fresh making)取1片溶解于2ml ddH2O,并分装为200ul 一支，—20° C保存。
