凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量

第３１卷　第６期 陕西科技大学学报 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６　２０１３年１２月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｃ．２０１３倡　文章编号：１０００‐５８１１（２０１３）０６‐０１０９‐０５变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究宋宏新，刘　静，张　歌，李红心（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安　７１００２１）摘　要：主要采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ）对新鲜牛羊乳及其酪蛋白清蛋白的区别进行分析检测，对比研究两种电泳方法测定结果的差异，并用两种方法分别检测了掺入不同浓度牛乳的羊乳样品．结果显示ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法对牛羊乳酪白质的分离效果好，该条件下牛羊乳的区别主要是酪蛋白αｓ２‐ＣＮ和αｓ１‐ＣＮ，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ法则是对清蛋白分离效果较好，该条件下的主要区别是牛乳较羊乳多两条β‐乳球蛋白．两种电泳方法对掺入不同浓度的羊乳样品的检测阈值均为５％，但ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ效果更明显．关键词：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；乳蛋白质；羊乳牛乳蛋白质差别中图法分类号：ＴＳ２５２．４ 文献标识码：ＡＴｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥａｎｄｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥＳＯＮＧＨｏｎｇ‐ｘｉｎ，ＬＩＵＪｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｅ，ＬＩＨｏｎｇ‐ｘｉｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ′ａｎ７１００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｒｅｓｈｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋａｎｄｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｙｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）ａｎｄｎａｔｉｖｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｉｆｆｅｒ‐ｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｄｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｂｙｂｏｔｈｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｒｅαｓ２‐ＣＮａｎｄαｓ１‐ＣＮ，ｗｈｉｌｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｓｅｐａｒａｔｅａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｔｈａｔｃｏｗｍｉｌｋｈａｓｔｗｏβ‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｂｕｔｇｏａｔｍｉｌｋｈａｓｎ′ｔ．Ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆｔｈｏｓｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｏｆｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ‐ｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｉｓ５％．Ｂｕｔｔｈｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｉｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；ｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ倡收稿日期：２０１３‐１０‐１４基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（２０１３ＪＣ０３）作者简介：：宋宏新（１９５９－），男，陕西咸阳人，教授，研究方向：生物化学与分子生物学陕西科技大学学报第３１卷０　引言乳与乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及多种维生素［１］，是一类营养丰富的理想食品，牛乳和羊乳是两类重要的乳品工业原料．羊乳的营养物质易于吸收、风味独特［２］，但羊乳资源相对匮缺，致使其市场价高量少，在利益驱动下不法商贩将牛乳掺入羊乳中降低成本，这种掺假不仅存在于羊乳及其制品中，更多地会出现在原料乳的收购过程．国际贸易对羊乳制品纯度要求高（大于９５％），羊乳制品企业在生产经营过程对原料及产品的保真性检验是一个急待解决的问题，基于牛羊乳成分的差异比较研究是解决羊乳中掺入牛乳成分的技术关键．羊乳与牛乳的外观和主要化学成分相似，其差别主要是在脂肪酸、蛋白质种类等微观组成上．乳蛋白质是乳制品的重要营养质量指标之一，乳蛋白质主要包括酪蛋白和乳清蛋白两大类［３］，乳脂肪球膜蛋白的含量相对较少．蛋白质的电荷和分子质量特性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）是蛋白质分离分析的良好方法，ＰＡＧＥ分为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），两种电泳系统的主要差别是ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ添加ＳＤＳ和疏基乙醇变性剂，并在加热条件下将聚合蛋白质充分变性为亚基进行分离，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ不含变性剂，多在低温条件下对天然构象的蛋白质（寡聚或单体）进行分离．ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ是乳品蛋白质研究应用最广泛的方法［４］，ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ的研究报道较少，本实验通过对牛羊乳在变性及非变性条件下的电泳分析，建立分析牛羊乳蛋白质的方法，通过比较牛羊乳的蛋白质差异为羊乳中掺入牛乳成分的分析检验提供依据．１　材料与方法１．１　实验仪器分析天平（万分之一克），北京赛多利斯仪器系统公司；Ｔ‐１０００型电子天平，江苏常熟双杰测试仪器厂；ＨＣ‐３０１８Ｒ高速冷冻离心机；ＷＨ‐３微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；移液枪，德国艾尔德股份有限公司；１０１‐２Ａ型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；ＰＢ‐１０型酸度计，北京赛多利斯仪器系统公司；恒温水浴锅，国华电器有限公司；ＴＳ‐２型脱色摇床、恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ＨｏｅｆｅｒｍｉｎｉＶＥ型电泳槽，美国ＧＥ公司；ＢＧ‐Ｐｏｗｅｒ６００型电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；ＪＤ‐８０１型捷达图像分析系统，江苏省捷达软件工程有限公司．１．２　实验药品及材料主要试剂：丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ‐甲叉双丙烯酰胺，优级纯，美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），优级纯，美国ＵＳＢ公司；过硫酸铵，分析纯，北京化学试剂厂；四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ），优级纯，北京化学试剂厂；α‐乳白蛋白、β‐乳球蛋白：美国Ｓｉｇｍａ公司；分子量标准蛋白Ｍａｋｅｒ，科昊生物工程有限责任公司；硫酸铜、硫酸钾、Ｔｒｉｓ‐Ｂａｓｅ、巯基乙醇、考马斯亮兰Ｒ‐２５０、甘油、溴酚蓝、盐酸、甲醇、冰乙酸等其它常用试剂为分析纯级．１．３　样品及处理牛乳：西安未央区韩家湾奶牛场当天产的鲜乳．奶牛健康状况良好，无乳房炎、消化道疾病等．羊乳：西安市北郊夏家堡某农户家关中奶山羊当天产的鲜乳．脱脂牛、羊乳：取新鲜牛、羊乳在４℃５０００ｒ／ｍｉｎ下离心３０ｍｉｎ，弃去上层脂肪即得．牛、羊乳酪蛋白：酪蛋白的制备方法采用的是等电点沉淀法［５］，脱脂乳加热３７℃，用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ（牛乳调至ｐＨ４．６，羊乳调至ｐＨ４．１），４０℃保温３０ｍｉｎ沉淀酪蛋白，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，下层沉淀干燥即为酪蛋白．保留上清液用于清蛋白制备．牛、羊乳清蛋白：上步保留的离心上清过滤除去残留酪蛋白颗粒即为清蛋白液．羊乳中掺入不同比例牛乳样品的制备：分别取脱脂乳按脱脂羊乳和脱脂牛乳体积比（Ｖ∶Ｖ）９５∶５、９０∶１０、８０∶２０、７０∶３０、６０∶４０、５０∶５０分别混匀，即制得掺入５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％脱脂牛乳的脱脂羊乳样品．α‐乳白蛋白：准确称量０．０１ｇα‐乳白蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．β‐乳球蛋白：准确称量０．０１ｇβ‐乳球蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．１．４　电泳方法１．４．１　ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（１）样品处理：２×变性样品缓冲液（ｐＨ８．０：０．１２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ，２％ＳＤＳ，１０％甘油，０．１％溴酚蓝，５％巯基乙醇，调完ｐＨ后再加巯基乙醇）．·０１１·第６期宋宏新等：变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究脱脂乳用蒸馏水稀释５倍，取一定量与等体积２×变性样品缓冲液混合．乳酪蛋白样品用０．０５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液溶解成乳酪蛋白浓度６ｍｇ／ｍＬ，取一定量与等体积的２×变性样品缓冲液混合．乳清蛋白样品直接与等体积的２×变性样品缓冲液混合．α‐乳白蛋白和‐β‐乳球蛋白标准液与等体积的２×变性样品缓冲液混合．掺入不同比例脱脂牛乳的脱脂羊乳样品与等体积的２×变性样品缓冲液混合．所有样品电泳前用混合仪混匀，煮沸５～１０ｍｉｎ，１０μＬ进样．（２）电泳及分析［６］：分离胶质量浓度为１２．５％，浓缩胶质量浓度为３％［７］，凝胶厚度为１ｍｍ的垂直不连续ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ，缓冲系统中含０．１％ＳＤＳ，预电泳电流为１５ｍＡ，样品进入分离胶后调到３０ｍＡ．电泳结束后用考马斯亮蓝Ｒ‐２５０染色，甲醇、冰醋酸溶液脱色，用捷达图像分析系统对电泳图片进行扫描．以ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分子量标准制作蛋白质（亚基）分子量对数与电泳迁移率的标准曲线，该曲线方程为ｌｏｇＭＷ＝－１．３７９ｘ＋２．１３４（ＭＷ—蛋白质分子量；ｘ—电泳迁移率），Ｒ２＝０．９６９，计算各蛋白组分的分子量大小．１．４．２　ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（１）样品处理：２×非变性样品缓冲液不含ＳＤＳ和巯基乙醇（１．２５ｍＬｐＨ６．８，０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ，３．０ｍＬ甘油，０．２ｍＬ０．５％溴酚蓝，５．５ｍＬ水．）乳酪蛋白固体样品的溶解，其它乳品样的稀释，液体样品与２×非样品缓冲液等体积混合与ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ样品处理相同，不同的是样品仅需用混匀仪充分混合不加热，１０μＬ进样．（２）电泳及分析［８］：分离胶质量浓度为８％，浓缩胶质量浓度为５％［９］，凝胶厚度为１ｍｍ的垂直不连续ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ，缓冲系统不含ＳＤＳ，预电泳电流为１５ｍＡ，样品进入分离胶后调到２０ｍＡ．为防止蛋白质在电泳过程中变性，电泳在０～４℃进行．电泳结束后染色脱色等程序同ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ．２　实验结果与分析２．１　ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ电泳结果见图１（左）．Ｍ．分子量标准蛋白质；１．脱脂羊乳；２．脱脂牛乳；３．羊乳酪蛋白；４．牛乳酪蛋白；５．羊乳清蛋白；６．牛乳清蛋白；７．α‐乳白蛋白；８．β‐乳球蛋白图１　脱脂牛羊乳及清蛋白酪蛋白的ＳＤＳ‐ＰＡＧＥＥ（左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（右）图谱 ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ电泳可以将蛋白质变性为亚基，按其分子量大小进行分离，图１（左）显示从电泳的负极（上）到正极（下）可以显示乳中蛋白质（亚基）含量较大的组分有８种，依据分子量标准及两种牛乳α‐乳白蛋白和‐β‐乳球蛋白标注蛋白质，将其分为上（高分子量）、中（中分子量）和下（低分子量）３组，对其分子量和蛋白质种类进行以下讨论：上端的高分子量区域主要为血清白蛋白（７２．１ＫＤ）和免疫球蛋白（ＩｇＧ），ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ看到的ＩｇＧ只是由于巯基乙醇和ＳＤＳ变性裂解的ＩｇＧ的重链［１０］，羊乳ＩｇＧ重链的分子量（５６．９ＫＤ）较牛乳（５７．８ＫＤ）小．下端的小分子量组主要为β‐乳球蛋白（１２．０ＫＤ）及α‐乳白蛋白（１０．４ＫＤ），仅从分子量看，在此区间牛羊乳的差别不大．由图可见羊乳·１１１·陕西科技大学学报第３１卷（泳道５）和牛乳（泳道６）清蛋白主要分布在高分子量和低分子量区．中间的中分子量区主要为羊乳和牛乳酪蛋白（泳道３和泳道４）：αｓ１‐ＣＮ、αｓ２‐ＣＮ、β‐ＣＮ和κ‐ＣＮ４种，牛羊乳的差别明显，羊乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３５．９ＫＤ）大于牛乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３４．２ＫＤ），牛乳α‐ＣＮ含量比较多，羊乳β‐ＣＮ含量（条带更深）比较多．可见ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ对两种乳品蛋白质的分离较好，电泳条带多而清晰，并且有较好的重复性，两种乳品酪蛋白的区分最好．２．２　ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ电泳结果见图１（右）．ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ分离羊乳及牛乳蛋白质的电泳图谱条带明显比ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ条带少，中间区域的酪蛋白仅有两条，且条带拖尾不清晰，虽然也能显示两种乳品（泳道３和泳道４，泳道１和泳道２）的差别，但是信息量较少，推测是由于多种酪蛋白以胶束状态在ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ时泳动的特点．在下端的低分子区域可以看出乳清蛋白分离效果良好．羊乳与牛乳清蛋白的差别明显：羊乳清蛋白（泳道５）仅为一条带，表明羊乳非变性条件下羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个较大的羊乳清蛋白（寡聚蛋白）而存在；牛乳清蛋白（泳道６）可分为三条，一条为牛α‐乳白蛋白（泳道７），最下端的两条为牛β‐乳球蛋白（泳道８），显示牛β‐乳球蛋白有两种不同聚合形式存在．比较两种牛标准清蛋白的ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ和ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ图谱发现：图１（左）中牛α‐乳白蛋白亚基是分子量最小的一条带（图１左泳道７），图１（右）则显示牛α‐乳白蛋白（图１右泳道７）分子量较牛β‐乳球蛋白大；图１（左）显示牛α‐乳白蛋白亚基仅一条带，图１（右）则为两条，此现象的合理解释是两种乳清蛋白的天然（非变性）状态都是由相同亚基（图１左为一条带）的多个亚基聚合而成的寡聚蛋白．ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ分离乳蛋白质的条带虽然较少，但是对清蛋白的分离效果良好，明显的差别是最下端的牛乳较羊乳体多两条β‐乳球蛋白条带，可以作为区别牛羊乳的良好标志．２．３　两种电泳方法检测羊乳中掺入牛乳结果及分析羊乳中掺入不同比例牛乳样品的两种电泳分析结果见图２．１．脱脂牛乳；２．脱脂羊乳；３‐８．分别为掺入５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％脱脂牛乳的脱脂羊乳图２　羊乳中掺入牛乳的ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（右）图谱 比较ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（图２左）和ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ（图２右）图谱可以看出，前者分离乳蛋白质的条带多而清晰，能够比较全面的表征乳蛋白质的组成．ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ图谱显示牛乳ＩｇＧ－Ｈ分子量比羊乳大，含量较羊乳少，最明显的差别是酪蛋白αｓ２‐ＣＮ的分子量和αｓ１‐ＣＮ含量，牛乳αｓ１‐ＣＮ含量较羊乳多（条带颜色较深），当向羊乳中掺入５％含量的牛乳时（图２左，泳道３）就可以看出条带的差异．图２（右图，泳道１和泳道２）显示ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ对酪蛋白及高分子量清蛋白分离不好，但是最前端小分子乳清蛋白差别明显，牛乳较羊乳多出两条β‐乳球蛋白条带，羊乳随着掺入脱脂牛乳比例·２１１·第６期宋宏新等：变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究的变化，β‐乳球蛋白条带（泳道２‐８）从无到有并逐渐加深，两条β‐乳球蛋白条带可以作为羊乳中掺入牛乳的特征蛋白，实验显示的检测阈值为５％．比较羊乳和牛乳蛋白质差异，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ显示的αｓ２‐ＣＮ和αｓ１‐ＣＮ在较多的蛋白质条带中较难区分，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ显示的两条β‐乳球蛋白条带从无到有更易观察识别，以其差别为基础建立的羊乳中掺入牛乳成分更可取．３　结论对牛乳和羊乳及由其制得的酪蛋白清蛋白进行两种电泳方法分析比较发现以下特点：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法由于变性可以将聚合蛋白变性成单体蛋白质或亚基，该条件下的电泳分离效果好，可以显示更多的电泳条带（８～１０条），在该条件下牛羊乳最主要的差别是酪蛋白，羊乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３５．９ＫＤ）大于牛乳αｓ２‐ＣＮ分子量（３４．２ＫＤ），羊乳αｓ２‐ＣＮ含量较高，而牛乳αｓ１‐ＣＮ含量较高（条带更深）；ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ法乳品中蛋白质是以天然（非变性）的完整聚合蛋白质进行分离，酪蛋白变条带少（几种酪蛋白聚合成酪蛋白胶束）且分离效果较差；小分子量的乳清蛋白分离好，羊乳有一条较大的羊乳清蛋白（羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个蛋白质），而牛乳清蛋白分有一条牛α‐乳白蛋白，最下端有两条牛β‐乳球蛋白，这也是ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ显示羊乳和牛乳蛋白质最明显的差别，可以作为羊乳中掺入牛乳的检测特征目标蛋白．比较而言，ｎ‐ａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ更能明显区分牛羊乳，当羊乳中掺入５％牛乳时，在ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ电泳图谱中就可以看出明显差异．从电泳操作方法比较，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ比较成熟，结构较稳定，反映的酪蛋白种类信息更多，ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ试剂少不变性，要求在较低温度下进行，蛋白质的溶解性对分析影响较大，更适应于乳清蛋白分析，可以作为羊乳中掺入牛乳的有效检测方法之一．进一步比较两种电泳清蛋白电泳结果，天然状态的羊乳清蛋白与牛乳清蛋白的差别显著，然而，有关羊乳清蛋白质中的乳白蛋白和乳球蛋白是如何聚集和其蛋白质结构特点的细节，还有待更深入的蛋白质结构解析研究，羊乳清蛋白质与牛乳清蛋白质的不同，究竟是如何影响羊乳的加工和营养消化特性也有待研究．ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ可以作为羊乳中掺入牛乳成分的有效检测方法．参考文献［１］唐　萍，田　晶，佘振宝．奶制品中蛋白质测定的毛细管电泳法研究［Ｊ］．分析科学学报，２００６，２２（１）：５‐８．［２］程潄兰，姚　莉，崔惠玲，等．ＷＴＯ背景下的中国奶业发展前景［Ｊ］．农业经济问题，２００２，２３（３）：１２‐１４．［３］宋宏新，刘立新，柏红梅，等．牛乳中蛋白质的电泳分析技术研究［Ｊ］．食品与机械，２０１０，２６（６）：５１‐５３．［４］陈丹华．蛋白质凝胶电泳及其分析应用［Ｊ］．分析科学学报，１９９５，１１（３）：７５‐８６．［５］汪家政，范　明．蛋白质技术手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２０００：６７．［６］韩奕奕，黄菲菲，王建军，等．凝胶电泳法（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）测定乳与乳制品中β‐乳球蛋白的含量［Ｊ］．乳业科学与技术，２００９，３２（２）：７４‐７７．［７］宋宏新，李敏康．现代生物化学实验技术教程［Ｍ］．陕西：陕西人民出版社，２０００：１６０‐１６２．［８］ＨａｍｅｓＢ．Ｄ．，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄｅｄｓ．Ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｐｒｏ‐ｔｅｉｎｓ：Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：ＩＲＬＰｒｅｓｓ．，１９８１．［９］希尔德布兰特Ｆ，伊格莱西Ｐ．分子医学技术［Ｍ］．林建银，译．北京：北京科学出版社，２００１：５４‐５６．［１０］ＫｉｎｇｈｏｒｎＮＭ，ＮｏｒｒｉｓＣＳ，ＰａｔｅｒｓｏｎＧＲ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓｔｏａｎａ‐ｌｙｓｅｂｏｖｉｎｅｗｈｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，１９９５，７００：１１１‐１２３．·３１１·变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究作者：宋宏新， 刘静， 张歌， 李红心， SONG Hongxin， LIU Jing， ZHANG Ge， LIHongxin作者单位：陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021刊名：陕西科技大学学报（自然科学版）英文刊名：Journal of Shaanxi University of Science and Technology (Natural ScienceEdition)年，卷(期)：2013(6)1.唐 萍;田 晶;佘振宝奶制品中蛋白质测定的毛细管电泳法研究[期刊论文]-分析科学学报 2006(01)2.程潄兰;姚 莉;崔惠玲W T O 背景下的中国奶业发展前景 2002(03)3.宋宏新;刘立新;柏红梅牛乳中蛋白质的电泳分析技术研究[期刊论文]-食品与机械 2010(06)4.陈丹华蛋白质凝胶电泳及其分析应用 1995(03)5.汪家政;范 明蛋白质技术手册 20006.韩奕奕;黄菲菲;王建军凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量[期刊论文]-乳业科学与技术 2009(02)7.宋宏新;李敏康现代生物化学实验技术教程 20008.Hames B.D;D.Rickwood Gel electrophoresis of pro-teins:A practical approach 19819.希尔德布兰特F;伊格莱西P;林建银分子医学技术 200110.Kinghorn N M;Norris C S;Paterson G R Comparison of capillary electrophoresis with traditional methods to ana-lyse bovine w hey proteins 1995本文链接：/Periodical_xbqgyxyxb201306024.aspx。

牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化
吴凤;王志耕;王子龙;董娟娟
【期刊名称】《包装与食品机械》
【年(卷),期】2008(026)004
【摘要】结合硫酸铵分段盐析和凝胶层析两种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白.通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:①在20%～30%、70%～80%盐析段只有两条带,分别是β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白带,得到较纯的蛋白;②再用SephadexG-50凝胶过滤层析,电泳结果显示只有一条带,并与标准β-乳球蛋白带一致,得到较纯的β-乳球蛋白.
【总页数】3页(P32-33,40)
【作者】吴凤;王志耕;王子龙;董娟娟
【作者单位】安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036;安徽农业大学畜产品品质与工程研究室,合肥,230036
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.4
【相关文献】
1.消除乳清蛋白中β-乳球蛋白致敏性的研究进展 [J], 李永涛;张兰威;孔保华
2.人乳、牛乳、羊乳中乳清部分氨基酸组成及乳清蛋白中蛋白质二级结构的对比[J], 张熙桐;关博元;孔繁华;刘彪;陶冬冰;武俊瑞;岳喜庆
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4.高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α乳白蛋白和β乳球蛋白及其改性降敏 [J], 赵倩如;朱丽英;赵权宇;江凌
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I FOOD INDUSTRY I 97FOOD INDUSTRY I THEORYSDS-PAGE法对乳及乳制品中主要蛋白的定性和定量分析文 刘利娟鹤壁职业技术学院肪层，留取清液备用，清液、水、样品缓冲液以1:1:2的混合，沸水浴加热10min ，10000r/min 离心10min ，取清液分装，备用。

称取1g 婴幼儿配方奶粉样品，用双蒸水定容至10mL ，10000r/min ，转速下离心15min ，步骤同鲜牛乳样品。

1.3.2 电泳条件配制15%分离胶：30%丙烯酰单体胺储备6mL,分离胶缓冲液3mL ，10%SDS 120μL ，双蒸水3mL ，10%过硫酸铵60μL ，TEMED 6μL 。

配制4%浓缩胶：30%丙烯酰单体胺储备0.67mL ，浓缩胶缓冲液1mL ，10%SDS 40μL ，双蒸水3.33mL ，10%过硫酸铵30μL ，TEMED 10μL 。

将制备好的胶放入电泳槽内，加入电极缓冲液，将梳子垂直缓慢地拔出，分别对样品和标准品进行不同浓度、不同体积进样。

预电泳电压80V ，分离胶与浓缩胶分界处改为130V 电压完成电泳。

0.1%考马斯亮蓝溶液染色1h ，脱色液洗脱过夜，至凝胶背景为透明无色。

2. 结果与分析2.1 分离胶浓度的选择SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。

本实验采用不连续系统的优点在于样品可以在进入分离胶之前在浓缩胶上达到相同的速度，即使样品达到相同的初速度和初始值。

带电胶粒在电场作用下向着与自身相反的电荷方向移动，且分子量越小的粒子，受到的阻力越小，分子迁移的速度越快，分子量越大的粒子收到的阻力越大，迁移速度婴幼儿配方奶粉是以母乳为标准，选自优质乳牛的奶源，对牛奶的主要蛋白质成分调整，使其最大限度地接近母乳，从而更适合婴儿的肠胃吸收和营养需求。

牛乳中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两个重要组成部分，其中酪蛋白占乳总蛋白含量约80%，酪蛋白主要包含αs 1-酪蛋白、αs 2-酪蛋白、β-酪蛋白和Ƙ-酪蛋白四种蛋白质，分别占总酪蛋白的比例为4:1:4:1，乳清蛋白占乳总蛋白含量约20%，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白（Q-LA ）、β-乳球蛋白（B-LG ）、免疫球蛋白（Ig ）和牛血清蛋白（BSA ）组成，分别占总乳清蛋白的5:2:8:5。

牛乳与母乳中低聚糖的测定方法及其不同泌乳时期变化规律的研究低聚糖是指重量分子量低于5000的有机物，通常由几个到几十个单糖单元组成的糖链，广泛存在于植物和动物体内，具有重要的生理活性和生化功能。

近年来，随着牛奶和母乳中低聚糖的研究日趋深入，人们对不同泌乳时期牛乳和母乳中低聚糖的测定及其变化规律的研究也变得越来越重要。

牛乳和母乳中低聚糖的测定方法主要包括凝胶电泳（SDS-PAGE）、液相色谱法（HPLC）和比色法（Colorimetry）等。

凝胶电泳是目前最常用的一种方法，可以有效地检测到牛乳和母乳中的低聚糖。

该方法的原理是将低聚糖通过特定的溶剂缓冲溶液中的聚合物进行电泳，然后通过分析电泳gels中形成的条带来评价低聚糖含量。

液相色谱法则主要用于测定低聚糖的种类和其组成百分比，其原理是通过溶剂提取牛乳和母乳中的低聚糖，再分析其在各次色谱柱上异构体色谱表现。

比色法则可以实时检测低聚糖的含量，其原理是通过对低聚糖的特定反应，使低聚糖同时与其他物质发生可见的化学反应，从而可以通过测定发生反应后的颜色深浅来判断低聚糖含量。

不同泌乳时期牛乳和母乳中低聚糖的变化规律表明，孕期牛乳和母乳中的低聚糖含量较低，而初乳中的低聚糖含量明显高于孕期的水平。

在产后的泌乳期，低聚糖含量会逐渐减少，但仍然保持较高水平，并且泌乳时期低聚糖的组成也发生了变化，其中葡萄糖和木糖含量明显高于孕期。

此外，由于母乳和孕期牛奶中低聚糖的组成有所不同，母乳中的麦芽糖含量明显高于牛乳，而前者中木糖和阿拉伯糖含量较低。

从上述变化规律可知，牛乳和母乳中低聚糖含量以及其组成在泌乳时期有明显的变化，对其营养价值和生理功能产生了重要的影响。

因此，基于对不同泌乳时期牛乳和母乳中低聚糖的测定和分析，我们可以更深入地了解其营养成分，从而为妈妈们和宝宝们提供更多的营养保健建议。

综上所述，牛乳和母乳中低聚糖的测定方法及其不同泌乳时期变化规律的研究极具重要意义，针对这一问题的研究有助于我们更好地理解牛乳和母乳中的营养成分，从而为妈妈们和宝宝们提供完善的营养保健建议。

乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定
邵秋荣;张文;方邢有
【期刊名称】《分析试验室》
【年(卷),期】2009(28)B05
【摘要】用12%的三氯乙酸沉淀乳与乳制品中的原蛋白,过滤沉淀后,检测乳与乳制品中的非蛋白氮的含量。

滤液经与硫酸铜、硫酸钾一同加热消化,使氮分解,分解出的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,用0.01 mol/L HCl滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为样品中非蛋白氮的含量。

【总页数】2页(P240-241)
【关键词】乳;乳制品;蛋白;氮含量;掺假
【作者】邵秋荣;张文;方邢有
【作者单位】顺德出入境检验检疫局
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.1;S823.5
【相关文献】
1.凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中β-乳球蛋白的含量 [J], 韩奕奕;黄菲菲;王建军;吕春
2.乳制品中非蛋白氮含量测定的不确定度评定 [J], 陈永元;乐琼
3.信息化教学在高职“乳与乳制品检测技术”课程中的应用——以乳及乳制品酸度的测定为例 [J], 池慧芳; 韩永霞; 高丽霞
4.碱水解法测定乳及乳制品中脂肪的含量 [J], 晏凯; 刘晓彤; 刘悦; 李凤娟; 于磊; 马英伟; 李培丹
5.信息化教学在高职“乳与乳制品检测技术”课程中的应用——以乳及乳制品酸度的测定为例 [J], 池慧芳;韩永霞;高丽霞
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乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测乳与乳制品中常见的蛋白质种类包括酪蛋白、乳清蛋白和乳酸菌蛋白等。

其中，酪蛋白是乳与乳制品中最主要的蛋白质组分，占据了乳中总蛋白质的75%以上。

乳清蛋白是乳与乳制品中的另一主要蛋白质成分，它具有良好的水溶性和生物利用度。

常规理化指标检验蛋白质含量的方法主要有几种，包括Kjeldahl法、琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱法等。

Kjeldahl法是一种用于测定有机氮含量的经典方法，也是乳与乳制品中蛋白质含量检测的常用方法之一、该方法的原理是通过将样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后将氨基酸转化为氨，并以氨的形式测定样品中的氮含量。

通过乘以适当的因子，可以计算出样品中蛋白质的含量。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可以用于检测乳与乳制品中蛋白质的组成和含量。

该方法利用蛋白质在电场中的迁移速率与其分子量之间的关系，通过测定蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以推断出蛋白质的分子量和含量。

紫外吸收光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下具有吸光性的原理，通过测定吸收光谱的变化来确定样品中蛋白质的含量。

这种方法简单、快速，并且无需破坏性地处理样品，因此在乳与乳制品中蛋白质含量的检测中得到了广泛应用。

除了上述常见的方法外，还有其他一些新型的蛋白质检测方法正在不断发展中，例如质谱法、免疫测定法等。

这些方法具有高灵敏度和高选择性，能够准确地测定乳与乳制品中蛋白质的含量。

在实际的生产和质量控制中，对乳与乳制品中蛋白质含量的检测是至关重要的。

通过对产品中蛋白质含量的监测，可以及时发现和解决质量问题，确保产品的标准化和稳定性。

总之，常规理化指标检验乳与乳制品中蛋白质含量的方法多种多样，每种方法都具有其特定的优点和适用范围。

选择适当的方法，并根据实际情况进行合理的检测，对于乳与乳制品的生产和质量控制具有重要的意义。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）检测牛
奶中掺杂的豆奶
赵慧芬
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】1996(017)011
【摘要】十二烷基硫酸钠内烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）是检测手半定量牛奶、豆奶混合物中的豆奶和牛奶蛋白的非常有效的方法。

蛋白分离不需要制备缓冲液，考马斯兰染色可快速命同性好，灵敏度高和背景染色弱的结果，样品中需稀释到合适的浓度（总蛋白浓度大约３．６ｎｇ），从电流产上可清晰地看到条牛奶蛋白带和１３条豆奶蛋白带，本文给它们的一。

当牛奶和牛奶混合时，许多蛋白带都可用于检测混合物中的豆奶和牛奶，牛奶中掺杂的豆
【总页数】4页(P50-53)
【作者】赵慧芬
【作者单位】北京奶牛中心
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.7
【相关文献】
1.牛奶的冰点测定及利用冰点不降检测牛奶中掺水及其他掺杂技术 [J], 孙长青;王世平
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在拟糖蛋白检测中的应用 [J], 方丽莎;谢珍茗;余倩;余
林
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在拟糖蛋白检测中的应用 [J], 方丽莎;谢珍茗;余倩;余林
4.检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中家蝇蛋白的新方法--海波银染法 [J], 安春菊;耿华;李德森;杜荣骞
5.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）检测牛奶中掺杂的豆奶[J], 赵慧芬
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一、实验目的和要求1．学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法。

2．蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析。

3．学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法。

二、实验内容和原理1.电泳是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。

2．电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。

3.区带电泳：是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。

4．聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,简称PAG) 是由丙烯酰胺（Acr)和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有引发剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。

6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：⑴连续系统：凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。

该电泳系统具有电荷效应、分子筛效应；⑵不连续系统：凝胶缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。

由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。

该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。

7.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。

为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS）”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品就会与SDS结合形成带负电荷复合物，而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级和三级结构，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。