植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报

森林根际土壤细菌的分离、鉴定及生物活性筛选冯路遥;赵江源;施竹凤;莫艳芳;杨童雨;申云鑫;何飞飞;李铭刚;杨佩文【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2024(40)1【摘要】【目的】从无量山国家级自然保护区森林根际土壤发掘具有多种生物活性的功能菌株,探究其开发应用潜力。

【方法】采集无量山地区25个区域植物的根际土壤,采用选择培养基,分离鉴定磷酸盐溶解、固氮、溶锌和拮抗等活性菌株,进一步测定菌株分泌铁载体、ACC脱氨酶和吲哚乙酸等生物活性,并验证促番茄种子发芽和生长效果。

【结果】分离鉴定得到解磷菌70株,固氮菌27株,解钾菌8株,拮抗镰刀菌的菌株51株。

其中,YIM B08401和YIM B08402形态学结合生理生化特性和16S rDNA序列测序,鉴定为白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba)和青岛假单胞菌(Pseudomonas qingdaonensis),两个菌株均具有磷酸盐溶解、固氮、溶锌和分泌铁载体的活性,最大可溶性磷含量为(455.63±59.65)mg/L和(878.95±64.78)mg/L;两株菌的促种子发2芽试验结果接近,施加稀释10倍、10倍和310倍的发酵上清液后,发芽率都维持在82%-93%,明显高于对照组的56%和49%,施加菌株发酵液的处理组相较于空白对照组的长度都有显著增加。

盆栽实验证明,两株菌株促生效果最明显的处理组在地上部长度、鲜重、干重、茎粗、根长、根鲜重、根干重方面的数据都显著优于对照组,YIM B08401的上述指标相对于对照组分别显著增加了89%、495%、268%、62%、53%、385%和469%,YIMB08402的上述指标相对于对照组分别显著增加了118%、528%、477%、55%、37%、413%和747%。

此外,菌株YIM B08401还具有拮抗病原菌和分泌ACC脱氨酶活性,YIM B08402则还具有分泌吲哚乙酸的活性。

一株缬草根际稀有放线菌的分离鉴定及其天然产物生物合成基因的筛查安晓英;马怡茗;刘香香;周童娜;颜华;贾良辉【摘要】采用梯度稀释涂布平板法分离缬草根际土壤中的放线菌,从高氏一号培养基上分离得到1株放线菌BJA-103,对该菌形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列进行鉴定,并用简并PCR方法对其多种天然产物生物合成关键酶基因进行筛查.经分类鉴定,初步确定BJA-103为Amycolatopsis coloradensis 的一个菌株;PCR筛查结果显示,该菌株含有非核糖体肽合酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ 型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)以及糖肽类抗生素合成关键酶P450单加氧酶的基因.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2016(025)007【总页数】7页(P1080-1086)【关键词】稀有放线菌;分类鉴定;16S rDNA;抗生素生物合成基因【作者】安晓英;马怡茗;刘香香;周童娜;颜华;贾良辉【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q935缬草隶属败酱科(Valerianaceae)缬草属(Valeriana)多年生草本，全世界约有250余种，中国约有28种，主产于西南、西北和东北地区。

缬草的根及根茎用于镇静安眠和解挛止痛[1-2]。

植物根际是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根的区域，通常指距离根表面1～4 mm，甚至更小的区域。

在植物根际区域内生长的微生物称为根际微生物。

根际是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面。

研究表明，根际放线菌产生抗菌抗生素和其他活性物质的比例显著高于根际周围土壤来源的放线菌[3]。

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集1 目的1.1 了解微生物分离和纯化的原理1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法2 原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

3 材料3.1 培养基淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。

3.2 仪器或其它用具取样铲、塑料袋、记号笔、1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。

一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。

应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。

2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。

如下示意图。

一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。

每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。

装入事先准备好的塑料袋内扎好。

北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。

3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。

红树林土壤稀有放线菌的分离及分类鉴定的开题报告一、研究背景红树林是在盐水海岸岩石上生长的一种特殊植被，具有独特的环境条件和生物多样性。

其土壤含有大量的盐分、重金属和有机质，是一种充满挑战性的生态系统。

研究红树林土壤中的微生物群落及其特殊代谢产物，对于理解这种生态系统的生态学和生化学基础，以及寻找具有药用和农业价值的化合物具有重要意义。

而放线菌是一类广泛存在于土壤、水体和植物内的微生物，具有广泛的生物活性和药用潜力，被广泛应用于医学、农业和工业领域。

因此，本研究旨在从红树林土壤中分离稀有放线菌，并进行分类鉴定及生物学特性研究，为发现具有生物活性的化合物提供基础。

二、研究内容1、红树林土壤中稀有放线菌的分离利用不同的分离方法，如平板培养、土砂平板法、稀释平板法和筛选法等，从红树林土壤样品中分离得到不同类别的放线菌，如链霉菌、放线菌、细菌素菌等。

并采取生理生化和基因技术等方法确定其菌株的特征。

2、菌株生产代谢产物利用发酵法对分离得到的稀有放线菌进行培养，并利用液相层析技术等方法分离得到主要的次级代谢产物。

并采用质谱分析技术对代谢产物进行鉴定和结构表征。

3、放线菌群落结构及差异分析通过16S/18S/ITS rDNA的扩增和测序，对红树林土壤中的放线菌菌群落结构及组成进行深入分析，并比较不同生态系统的放线菌群落的差异。

三、研究意义和预期结果本研究可以有效地分离与红树林区域土壤中稀有的放线菌，利用生理生化和基因技术等方法对其种类进行分类鉴定，为进一步进行相关应用提供了基础。

同时，通过对红树林土壤中放线菌的群落结构和代谢物的分离与鉴定，可以更深入地了解红树林土壤的微生物群落结构和生化代谢规律，为生态系统的保护和管理提供科学依据。

预期结果包括分离到稀有的放线菌株，鉴定、筛选出具有生物活性的代谢产物，并对红树林土壤中放线菌的群落结构进行分析和比较。

四、研究方法和技术路线1、样品采集与处理：收集红树林区域的土壤样品，并进行过滤、稀释等处理。

·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2012年第2期收稿日期: 2011-09-21基金项目:“973”前期项目（2007CB116306）作者简介:黄小龙,男,博士,研究方向:应用微生物资源;E -mail:hxl2012@通讯作者:洪葵,女,教授,博士生导师,研究方向:应用微生物资源;E -mail:k1022@热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析黄小龙1,2 陈吉良2 李建平2 林海鹏1 庄令1 李佳3 洪葵1,4（1中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口571101；2海南大学农学院，儋州571737；3国家新药筛选中心，上海 201203；4武汉大学药学院，武汉 430071）摘 要: 从海南热带植物园采集12种药用植物的根际土样，采用选择性分离方法，分离得到400株根际放线菌。

使用5种活性筛选模型对分离菌株进行生物活性评价，154株放线菌在一个或多个活性筛选模型中显示为阳性，菌株初筛阳性率达38.5%；根据菌株形态特征并结合代谢产物的生物活性，从中挑选出28株菌进行16S rRNA 基因序列分析，发现其分属于链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属和野野村菌属。

关键词: 药用植物 根际 放线菌 生物活性Isolation, Identification and Bioactivity of RhizosphereActinobacteria from Tropical Medicinal PlantsHuang Xiaolong 1,2 Chen Jiliang 2 Li Jianping 2 Lin Haipeng 1 Zhuang Ling 1 Li Jia 3 Hong Kui 1,4（1Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology Ministry of Agriculture Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology ，Chinese Academyof Agricultural Sciences ，Haikou 571101；2 Agronomy College ，Hainan University ，Danzhou 571737；3National Center for Drug Screening ，Shanghai 201203；4School of Pharmaceutical Sciences ，Wuhan University, Wuhan 430071）Abstract: A total of 400 strains belong to rhizosphere actinomycete were isolated from 12 rhizosphere soil samples of medicinal plant collected from tropical botanical garden in Danzhou city of Hainan province with selective isolation methods. All of the isolates were assessed using 5 models for their biological activities, and the fermentation broths from 154 strains exhibited activity on at least one screening model, the positive rate among the isolates is 38.5%. 28 strains among them were selected according to their morphological characteristics and bioactivities to determine their taxonomic position. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences indicated that the 28 strains belong to small group of actinobacterial genera including Streptomyces, Micromonospora, Nocardia, and Nonomuraea spp..Key words: Medicinal plant Rhizosphere Actinomycetes Bioactivity放线菌是植物根际环境中一类重要的微生物，在促进植物生长［1,2］、保护植物根系免受病原真菌的侵袭等过程中发挥重要作用［3］。

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604056鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的多样性分析及抗菌等生物活性评估王霏1，黎丹1，黄耀坚1，邓贤明1，吴莹莹2*（1.厦门大学生命科学学院天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海市农业科学院食用菌研究所，上海2 01406）摘要：为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性，筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株，本研究采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸两种培养基，选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京中山植物园及南京玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌，并进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析及抗菌、抗肿瘤生物活性测定. 共分离到178株放线菌，其中链霉菌151株，其余27株为稀有放线菌，占总数的15.2%. 稀有放线菌包含9个属：微杆菌属（Microbacterium）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、韩国生工菌属（Kribbella）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、小单孢菌属（Micromonospora）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium）和栖白蚁菌属（Isoptericola），包含2株新种. 对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵，并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性. 结果显示，所测定的178株放线菌中，有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性，占供测菌株的46.1%；有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用，占供测菌株的33.7%. 研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富，其中抗菌和抗肿瘤活性显著的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源.关键词：放线菌；选择分离；系统分析；活性测定中图分类号：Q 939 文献标志码：A放线菌是天然药物的重要来源，目前临床及农业上使用的抗生素中，超过60%是放线菌产生的[1]. 自1944年美国放线菌学家Walksman[2]从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中发现链霉素以来，大量新型抗生素被陆续从放线菌中分离得到，其中大部来自链霉菌，约占自然界来源抗生素总数的45%，另有16% 来自非链霉菌属的放线菌[3]. 随着对链霉菌资源的开发，从其中发现结构新颖的活性物质的几率不断下降. 近年来，人们逐渐将探索的目光转向非链霉菌属的放线菌，即稀有放线菌[4]. 稀有放线菌产生的生物活性物质结构类型丰富，包含大环内酯类、氨基糖苷类、肽类、蒽环类、氧杂蒽酮类等[5-6]，其中如抗MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的万古霉素（vancomycin）、替考拉宁（teicoplanin）、道古拉宁（dalbavancin），治疗细菌感染的庆大霉素（gentamicin）、红霉素（erythromycin），抗结核杆菌的利福霉素（rifamycin）、卷曲霉素（capreomycin），以及降糖药阿卡波糖（acarbose）等已经成功应用于临床[7].植物根际土壤是微生物的重要栖息地，它是由植物、土壤和微生物共同构成的一个微环境，三者之间相互作用、相互影响. 研究结果表明，植物根际土壤中的微生物多样性比非植物根际土壤中的丰富[8]. 根际微生物的代谢活动对于整个微环境中的碳循环、磷循环、植物固氮作用、调节植物根际微环境以及土壤中废物和毒素的清除都起到十分重要的作用[9]. 不同微生物在与植物和土壤进行相互作用的过程中，可能导致植物根际土壤的有机质含量、酸碱度等产生细微的差异，并反过来影响微生物的群落组成[10]. 放线菌在植物根际土壤微生物类群当中占有极其重要的地位，如在玉米等农作物的根际土壤中，放线菌属于优势菌，其含量仅次于变形杆菌[9]. 因此，本研究选择采集自两个地区的植物根际土壤样品作为放线菌的分离源，对分离到的放线菌菌株进行分类鉴定和多样性分析，并对其进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，旨在了解植物根际土壤中放线菌的多样性，挖掘新的稀有放线菌分类单元，并获得可用以活性物质分离的药源菌株，为后续微生物药物资源的开发奠定良好基础.1 材料与方法1. 1 材料1. 1. 1 样品来源植物根际土壤样品由研究人员分别采集自福建省厦门市（2012年10月）和江苏省南京市（2012年11月）. 其中以X开头的9份样品采自厦门市翔安区香山风景区（N 24°37′45.84″，E 118°17′56.73″），分别为植物飞扬草（Euphorbia hirta L.）、榕树（Ficus microcarpa Linn.f.）、红薯（Ipomoea batatas （L.）Lam.）、鬼针草（Bidens pilosa L.）、马樱丹（Lantana camara L.）、阴香（Cinnamomum burmannii）、紫茉莉（Mirabilis jalapa L.）、红花檵木（Loropetalum chinense var .rubrum）和凤凰木（Delonix regia）的根际土壤；以N开头的8份样品采自南京，分别为中山植物园（N 32°03′10.48″，E 118°49′40.66″）中水杉（Metasequoiaglyptostroboides）、桫椤（Alsophila spinulosa）、鹅掌楸（Liriodendron chinense）和金钱松（Pseudolarix amabilis （Nelson）Rehd.）的根际土壤，以及玄武湖公园（N 32°04′27.36″，E 118°47′19.58″）植物罗汉松（Podocarpus macrophyllus）、枫杨（Pterocarya stenoptera C. DC）、朴树（Celtis sinensis Pers.）和喜树（Camptotheca acuminata.）的根际土壤.1.1.2 主要试剂和仪器提取放线菌基因组DNA所用的溶剂按照《分子克隆实验指南》[11]进行配制. PCR所用的dNTP Mixture、Taq酶及琼脂糖凝胶电泳所用DNA Marker等购于宝生物工程（大连）有限公司公司. Beckman高速冷冻离心机购于美国Beckman公司，Tprofessional型PCR仪购于德国Biometra公司，Tanon GIS-2009型凝胶图像分析系统购于上海天能科技有限公司，DYY-8C型电泳仪购于北京六一仪器厂.1. 2 放线菌的分离方法1. 2. 1 样品预处理参考姜怡等[4]的方法，将采集好的土样分别摊开于通风处自然风干20~30 d（视土样湿度而定），用研钵将其研细，之后用200目的筛子过筛，收集至自封袋，妥存. 称取1 g样品装入盛有9 mL无菌水和小玻璃珠的50 mL无菌离心管中，摇床充分振荡后制成10-1稀释液，再以相同方法制备土壤样品的10-2和10-3梯度稀释液，用于涂布选择分离培养基.1. 2. 2 选择分离分别使用改良聚乳酸-明胶（PLA-G）[12]和海藻糖-脯氨酸（YIM 212）[13] 2种培养基对土样进行放线菌的选择性分离. 均加入重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮至终浓度50 mg/L，加入萘啶酮酸至终浓度为25 mg/L. 涂布平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养14~21 d后，挑取单菌落于高氏一号平板进行纯化.1. 3 放线菌的鉴定1. 3. 1 形态分类排重根据在固体培养基上的生长的菌落形状、颜色、是否产孢子、是否产可溶性色素等方面对所分离到的菌株进行形态分组.1. 3. 2 16S rRNA基因扩增及序列分析将纯化后的菌株接种至25 mL 胰蛋白胨大豆肉汤-酵母提取物（TSBY）液体培养基中，于28 ℃，220 r/min摇甁培养3~4 d. 采用吴莹莹等[14]的方法提取各菌株的基因组DNA. 采用通用引物27 F和1492 R扩增菌株的16S rRNA基因，并送至上海英潍捷基公司进行序列测定，用于系统分类研究. 测序结果提交在线分析网站EzTaxon-e （/eztaxon）进行相似性搜索，获得同源性相近的菌种序列. 运用MEGA6.06[15]的Neighbor-Joining 法构建系统进化树[16]，确定放线菌的分类地位. 对于最近似菌株的序列相似度低于98%且分类地位独特者，以TaKaRa公司的高保真酶对16S rRNA 基因再次扩增测序.1. 4生物活性实验1. 4. 1 放线菌发酵粗提物的制备采用酵母-麦芽提取物（ISP 2）[17]液体培养基进行发酵，每株菌发酵200 mL，于28 ℃，220 r/min发酵培养7 d. 乙酸乙酯萃取发酵液2遍，萃取液用旋转蒸发仪45 ℃减压浓缩成膏状物，称重后以甲醇定容至20 mg/mL，作为活性测定的母液.1. 4. 2抗菌活性实验采用滤纸片法[18]对分离得到178株放线菌的小量发酵粗提物进行抗菌活性测定. 指示菌包括金黄色葡萄球菌A TCC 25923（Staphylococcus aureus ATCC 25923，简称S.a）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372，简称 B.s）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus CMCC63202，简称B.p）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus ACCC 41016，简称M.l）、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，简称M.t）、大肠杆菌（Escherichia coli A TCC 25922，简称E.c）、黑曲霉（Aspergillus niger ACCC 30005，简称A.n）和白色假丝酵母（Candida albicans As 2.538，简称C.a）.1. 4. 3 抗肿瘤活性实验抗肿瘤活性采用噻唑兰(MTT)法[19]检测. 分别选用人胃腺癌细胞BGC-823、人肝癌细胞HepG-2、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549四株肿瘤细胞作为指示细胞株，粗提物样品的测定终浓度为50 μg/mL. 传代培养肿瘤细胞至浓度约为6×104个/mL. 样品孔及阳性、阴性对照孔内各加入80 μL细胞悬液，空白对照孔加入80 μL培养液. 每个样品进行三组平行测定. 置于37 ℃，1.5% CO2培养箱内培养24 h，加入待测样品. 于37 ℃继续培养72 h，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 溶液. 反应3~4 h，加入100 μL MTT终止液. 9~12 h后，用酶标仪测定OD值（波长595 nm），并计算样品对肿瘤细胞的抑制率.2结果和分析2. 1不同培养基的分离效果使用2种选择培养基，经分离纯化共得到178株放线菌. 其中148株分离自PLA-G 培养基，占分离总数的83.1%. 观察发现，PLA-G 分离平板上的放线菌数量和种类都比较丰富，且细菌和真菌等杂菌污染较少. 经16S rRNA 基因鉴定，有26株为稀有放线菌，比例为17.6%. 30株分离自YIM 212培养基，占总数的16.9%，其中仅1株为稀有放线菌，占3.3%. 在相同培养条件下，同一份土样在 YIM 212分离平板上长出的放线菌数量较少且种类单一， 并且出现较大范围的细菌污染，说明该培养基对放线菌的选择性较弱.由此可见，PLA-G 培养基对于放线菌的筛选效果优于YIM 212培养基，稀有放线菌的出菌率也较高.2. 2 放线菌的多样性178株放线菌中，107株分离自厦门香山的土壤样品，占总数的60.1%. 其中22株（20.6%）为稀有放线菌，分布于拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis ）、微杆菌属（Microbacterium ）、韩国生工菌属（Kribbella ）、野野村氏菌属（Nonomuraea ）、小单孢菌属（Micromonospora ）、链孢囊菌属（Streptosporangium ）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium ）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium ）和栖白蚁菌属（Isoptericola ）9个属. 71株分离自南京的土壤样品，占总分离数的39.9%，其中5株（7.0%）为稀有放线菌，分布于微杆菌属（Microbacterium ）、小单孢菌属（Micromonospora ）和链孢囊菌属（Streptosporangium ）3个属（图1）.选取分离所得放线菌各个属的代表菌株及其同属的标准参考菌株，构建16S rRNA 基因系统进化树，结果如图2所示. 进一步采用多相分类的方法对可能属于新分类单元的2株稀有放线菌XMU 506T （原始编号X5-6）和XMU706T （原始编号X7-6）进行新种鉴定，将其分别命名为马樱丹拟孢囊菌（Kibdelosporangium lantanae ）[20]和紫茉莉韩国生工菌（Kribbella mirabilis ）[21].a.304050607080t i n o m y c e t e s / (s t r a i n s )PLA 培养基YIM 212培养基b.注：Mba、Kri、Nom、Amy、Mon、Spo、Kib、Cel、Iso、Str分别表示微杆菌属、韩国生工菌属、野野村氏菌属、拟无枝菌酸菌属、小单孢菌属、链孢囊菌属、拟孢囊菌属、纤维菌属、栖白蚁菌属、链霉菌属.图1 厦门地区(a)和南京地区(b)植物根际土壤放线菌选择分离结果Fig. 1 Selective isolation of actinomycetes from Xiamen (a) and Nanjing (b) rhizosphere soil samples图2 根据16S rRNA 基因序列构建的植物根际土壤放线菌菌株系统进化树Fig. 2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing the diversityof actinobacteria isolated from rhizosphere soil Streptomyces olivaceus NRRL B-3009T (JOFH01000101) N2-4 (KT443806) Streptomyces somaliensis NBRC 12916T (AB184243) N1-24 (KT443800)Streptomyces glauciniger NBRC 100913T (AB249964)N1-1 (KT443793) X4-8 (KT581288) Nonomuraea roseoviolacea subsp roseoviolacea ATCC 27297T (AB039959)Nonomuraea bangladeshensis JCM 13930T (AB274966)Kibdelosporangium phytohabitan KLBMP 1111T (HM153787) Kibdelosporangium philippinens DSM 44226T (AJ512464)Kibdelosporangium lantanae XMU506T (KJ786942)Kibdelosporangium aridum subsp argum DSM44150T (AJ512463)X3-25 (KT581282) Streptosporangium canum HBUM 170018T (AJ512463)Kribbella antibiotica YIM_31530T (AY082063)Kribbella mirabilis XMU 706T (KM189813) Kribbella swartbergensis DSM_17345T （FN643223） Kribbella catacumbae DSM 19601T (AQUZ01000130)Micromonospora endolithica DSM_44398T (AJ560635)Micromonospora chersina DSM_44151T (X92628)N5-4 (KT443821)X1-15 (KT581264)Isoptericola nanjingensis H17T (HQ222356)N1-35 (KT443802)Microbacterium trichothecenolyticum DSM 8608T （JYJA01000006）N1-2 (KT443794)Microbacterium pseudoresistens CC-5209T (FJ865214)X6-36 (KT581320)Cellulosimicrobium funkei ATCC BAA-886T (AY501364)Amycolatopsis tolypomycina DSM_44544T (AJ508241) X2-6 (KT581268)Amycolatopsis bullii SF27T (HQ651730)Paracoccus fistulariae KCTC 22803T (GQ260189)6364100 82 99 75 100 99 100 88 99 9979 6485 99 99597812. 3 生物活性测定抗菌活性测定结果显示，有82株放线菌对至少一株指示菌具有抑制作用（抑菌圈直径≥6 mm），占供测菌株总数的46.1%. 其中37株对一种或多种指示菌具有较强的抑制作用（抑菌圈直径≥9 mm），占总供测菌株的20.8%（表1），包含8株稀有放线菌，分别为微杆菌属（Microbacterium）2株、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）3株、野野村氏菌属（Nonomuraea）2株、链孢囊菌属（Streptosporangium）1株. 其中，编号为X2-6、X2-10的2株拟无枝菌酸菌和编号为X3-25的链孢囊菌对多种指示菌都有显著的抑菌作用（抑菌圈直径>15 mm），其抗菌活性优于大多数链霉菌属菌株. 所分离到的放线菌主要对革兰氏阳性细菌表现出抑制作用，其中抗枯草芽孢杆菌的菌株数目最多；对供测的革兰氏阴性细菌几乎没有抗性，少部分菌株对真菌具有抑制作用.表1 178株植物根际土壤放线菌的抗菌活性Tab. 1 Antimicrobial activity of the 178 isolated actinomycetes抑菌圈直径活性菌株数（比例/%）不同指示菌的抗性菌株数（比例/%）B.s S.a B.p M.l M.t E.c A.nC.a直径≥6 mm82(46.1)54(30.3)51(28.7)46(25.8)46(25.8)23(12.9)(0.0)15(8.4)9(5.1)直径≥9 mm37（20.8）34(19.1)25(14.0)24(13.5)18(10.1)12(6.7)(0.0)8(4.5)4(2.2)采用MTT法进行抗肿瘤活性测定的结果显示，所分离的放线菌中有60株对至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用（抑制率≥50%），占供测菌株总数的33.7%. 其中，对一种或多种指示细胞株表现出较强抑制作用（抑制率≥90%）的有23株，占供测菌株总数的12.9%（表2），包含2株稀有放线菌，分别为野野村氏菌属（Nonomuraea）1株和韩国生工菌属（Kribbella）1株.表2 178株植物根际土壤放线菌的抗肿瘤活性Tab. 2 Antitumor activity of the 178 isolated actinomycetes肿瘤细胞株抑制率活性菌株数（比例/%）不同肿瘤指示细胞株的抗性菌株数（比例/%）BGC-823HepG-2MCF-7A549抑制率≥50%60(33.7)54(30.3)51(28.7)46(25.8)46(25.8)抑制率≥90%23(12.9)34(19.1)25(14.0)24(13.5)18(10.1)3 讨论选择合适的培养基对于选择分离稀有放线菌具有重要意义. 碳源是培养基的基本成分之一，寻找特殊的“稀有”碳源对于稀有放线菌的选择分离尤为重要. 采用聚乳酸（PLA）作为分离培养基的碳源进行放线菌的选择分离已有不少相关报道，大多数研究中采用的都是乳化PLA的方法[22-25]. 例如Jarerat[26]通过往PLA中加入氯仿使其乳化，然后真空抽干有机溶剂，制成PLA薄膜，再将其倒入基础培养基. 本研究对上述方法进行了改进，利用搅拌机将PLA颗粒直接打碎成粉末状，以此代替乳化处理方法，再将PLA粉末和明胶分别按0.1%的比例加入基础培养基当中配制PLA-G培养基. 采用PLA-G培养基从不同来源的植物根际土壤中共分离得到148株放线菌，且稀有放线菌出菌率高，分离效果远优于YIM 212培养基及已乳化PLA培养基. 由此说明，采用机械粉碎的PLA作为碳源制备的PLA-G培养基是优于YIM 212选择分离植物根际土壤中稀有放线菌的一种优良培养基.对本研究分离得到的178株放线菌进行16S rRNA基因序列分析结果表明，所有放线菌分布于7个科，10个属当中，呈现出良好的多样性. 其中107株分离自厦门市翔安区香山风景区的植物根际土壤样品，包含2株稀有放线菌新种，分离效果优于南京采集的土壤样品，尤其是稀有放线菌的多样性较为丰富. 香山风景区位于厦门市翔安区东南部，坐落于鸿渐山脉南麓的生态保护区和自然景观保护区，该地区植被繁茂，生态环境大多保持原始自然状态；南京中山植物园和玄武湖公园属于旅游观光景区，生态环境受人类活动的影响较大.由此可见，未经开发或自然生态环境保持较好的生态系统，其植物根际土壤也保持着较原始的状态，所以其中可能蕴含着更丰富的微生物资源.抗菌及抗肿瘤活性测定中，对至少一种指示菌和至少一种肿瘤细胞株具有抑制作用的活性菌株分别占供测菌株的46.1%和33.7%，进一步证明了所分离放线菌的次级代谢产物中可能蕴含着活性良好或结构新颖的化合物，具有极大的开发潜力，有待进一步深入研究.参考文献：[1] JÁNOS B. 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State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. National Engineering Research Center of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201406, China)Abstract: This study aimed to investigate the diversity of actinomycetes from rhizosphere soil in different regions, and to screen the strains with antibacterial and antitumor activity. The 16s rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis were used to explore the diversity of actinomycetes, which were isolated from 17 rhizosphere soil samples with two selective media. Using 6 bacteria, 2 fungi and 4 tumor cells as indicator to determine the biological acticity of actinomycetes. A total of 178 actinomycetes were isolated from rhizosphere soil, including 27 strains were rare actinomycetes, accounted for total 15.2%. The rare actinomycetes can be assigned 9 genera, which are Microbacterium, Amycolatopsis, Kribbella, Nonomuraea, Micromonospora, Streptosporangium, Kibdelosporangium, Cellulosimicrobium, Isoptericola, and 2 strains of them were novel species. Among them, 46.1% strains had antibacterial activity against one or more indicator, 33.7% strains had inhibitory activity of one or more tumor cells. The results showed that rhizosphere soil was a highly diverse actinobacterial communities，many of which appear to be novel candidate species. The actinomycetes having biological activity could be a promising source for secondary metabolites separation and microbial pharmaceuticals development.Key words: actinomycetes; selective isolation; phylogenetic analysis; bioactivity。

药用植物根际放线菌的种群多样性及生物活性初步研究袁丽杰;章广玲;张玉琴;余利岩;张月琴【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2009(034)008【摘要】从我国云南及重庆地区采集62份药用植物根际土样,采用多种选择性分离培养基,4种预处理方法,分离得到959株根际放线菌.所得放线菌菌株经发酵和多种筛选模型检测,显示出多种生物活性,初筛总阳性率达31%.根据菌株形态特征并结合代谢产物的生物活性,从中挑选出77株菌进行16S rRNA基因检测,发现其分属于17个不同的放线菌属,充分显示出药用植物根际放线菌的生物多样性.【总页数】5页(P463-466,504)【作者】袁丽杰;章广玲;张玉琴;余利岩;张月琴【作者单位】华北煤炭医学院,唐山,063000;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京,100050;华北煤炭医学院,唐山,063000;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京,100050;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京,100050;中国医学科学院医药生物技术研究所,北京,100050【正文语种】中文【中图分类】R379.1【相关文献】1.一株药用植物根际放线菌的分离鉴定及其生物活性初探 [J], 袁丽杰;朱丽华;张玉琴;余利岩;张月琴2.四川中江县药用植物根际土壤真菌与放线菌数量研究 [J], 胡容平;龚国淑;杨皓;卢代华;叶慧丽3.药用植物根际土壤放线菌的研究进展 [J], 晏丽4.热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析 [J], 黄小龙;陈吉良;李建平;林海鹏;庄令;李佳;洪葵5.不同地区药用植物两面针根际土壤真菌种群多样性差异分析 [J], 张淼;陈裕凤;陈龙;黄飘玲;韦露玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《四种荒漠珍稀植物根际土壤功能菌株的分离筛选及其促生作用研究》篇一一、引言荒漠地区，环境恶劣，生态脆弱，然而这里依然存在着许多珍稀植物种类。

这些植物之所以能够在如此严酷的环境中生存，很大程度上得益于其根际土壤中的功能菌株。

近年来，对于荒漠珍稀植物根际土壤功能菌株的研究日益受到重视，本文即以四种荒漠珍稀植物为研究对象，进行根际土壤功能菌株的分离筛选及其促生作用的研究。

二、材料与方法1. 材料选取四种荒漠珍稀植物，分别采集其根际土壤样品。

同时，准备必要的培养基、试剂和仪器设备。

2. 方法（1）根际土壤样品的采集与处理在荒漠地区，选择四种珍稀植物，避开人为干扰，采集其根际土壤样品。

将采集的土壤样品进行适当的处理，如晾晒、研磨、过筛等，以备后续实验使用。

（2）功能菌株的分离与筛选采用梯度稀释法和平板划线法，对根际土壤样品进行功能菌株的分离。

根据菌株的形态、生理生化特性及分子生物学鉴定等方法，对分离得到的菌株进行筛选。

（3）促生作用的实验研究通过盆栽实验和田间试验，研究筛选出的功能菌株对荒漠珍稀植物的促生作用。

观察植物的生长情况、生物量、叶绿素含量等指标，分析菌株的促生效果。

三、结果与分析1. 功能菌株的分离与筛选结果经过对四种荒漠珍稀植物根际土壤样品的分离筛选，共得到数十种功能菌株。

通过形态观察、生理生化特性分析和分子生物学鉴定等方法，初步确定了其中几种具有较高促生潜力的菌株。

2. 促生作用分析（1）盆栽实验结果在盆栽实验中，将筛选出的功能菌株分别接种到荒漠珍稀植物的根系周围。

观察植物的生长情况，发现接种菌株的植物生长明显优于未接种的对照组。

通过对植物生物量、叶绿素含量等指标的分析，进一步证实了功能菌株的促生效果。

（2）田间试验结果在田间试验中，将功能菌株应用于实际荒漠环境中，观察其对荒漠珍稀植物的促生作用。

结果表明，接种功能菌株的植物在生长速度、生物量、叶绿素含量等方面均表现出较大的优势。

四、讨论本项研究结果表明，四种荒漠珍稀植物的根际土壤中存在着多种功能菌株，这些菌株对于植物的生长具有显著的促生作用。

《四种荒漠珍稀植物根际土壤功能菌株的分离筛选及其促生作用研究》篇一一、引言荒漠地区因其独特的生态环境，孕育了众多珍稀植物。

这些植物在维持荒漠生态平衡、防止土地沙化等方面具有重要作用。

近年来，随着微生物生态学的发展，人们逐渐认识到根际土壤中的功能菌株对植物生长的促进作用。

本文以四种荒漠珍稀植物为研究对象，对其根际土壤中的功能菌株进行分离筛选，并探讨其促生作用，旨在为荒漠生态环境的保护与修复提供理论依据。

二、材料与方法1. 研究区域与植物选择选择我国典型荒漠区，如新疆、内蒙古等地，对四种荒漠珍稀植物进行调查和采样。

这些植物包括沙棘、红砂、白刺、肉苁蓉等，均为耐旱耐寒的植物种类。

2. 根际土壤样品采集与处理在生长旺盛期采集植物根际土壤样品，采用无菌操作法进行样品处理，以避免杂菌污染。

3. 功能菌株的分离与筛选采用梯度稀释法对根际土壤进行梯度稀释，将不同稀释度的土壤涂布于选择性培养基上，进行菌株的分离。

通过观察菌落形态、生理生化特性等指标，筛选出具有特定功能的菌株。

4. 促生作用研究采用盆栽试验法，将筛选出的功能菌株与荒漠珍稀植物共同培养，观察植物的生长发育情况，测定菌株对植物生长的促进作用。

三、结果与分析1. 功能菌株的分离与鉴定经过分离筛选，共获得四种荒漠珍稀植物根际土壤中的功能菌株。

通过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，确定这些菌株分别属于不同的菌属和种。

2. 促生作用研究结果（1）对植物生长的影响：将功能菌株与荒漠珍稀植物共同培养后，发现这些菌株对植物的生长具有明显的促进作用。

具体表现为植物株高、叶绿素含量、根系发育等指标均有所提高。

（2）对土壤环境的影响：功能菌株能够改善土壤环境，提高土壤肥力。

具体表现为土壤中有机质、全氮、全磷等含量有所提高，土壤微生物数量增加。

（3）菌株之间的互作关系：不同菌株之间在共生环境中存在一定的互作关系。

某些菌株之间具有协同作用，能够共同促进植物生长；而某些菌株之间则存在竞争关系，影响其在土壤中的生存和繁殖。

４８９放线菌是具有很高实用价值的一类微生物，作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。

目前，从微生物中发现１００００余种抗生素，约７０％为放线菌所产生。

不仅如此，放线菌还会产生酶制剂、氨基酸等有用物质。

因此，对放线菌资源的调查与开发显得尤为重要。

并且由于新物种具有产生新生物活性物质的潜力，人们开始尽可能寻找新放线菌，特别是用常规方法很少分离到的稀有放线菌。

根据Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ最早的概念，稀有放线菌是指那些用传统方法分离时，分离频度远低于链霉菌的放线菌。

稀有放线菌在土壤中分布量少，在人工培养基上生长缓慢，有的还有特殊的营养要求，按一般的分离和培养方法，获得的菌量很少。

近年来即认为链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属以外的为所谓稀有放线菌属。

分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。

几十年来，科研工作者发现，稀有放线菌能产生众多生物活性物质，包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等。

其中一些抗生素已商业化，产生巨大的社会和经济价值。

研究结果表明，环境中只有极少一部分微生物得到纯培养。

因此，分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一。

１、土壤预处理绝大多数的放线菌来源于土壤。

采集好土壤后的第一步是土壤的预处理，即对土壤样品或刚收集的水生地样品进行特殊的处理，用物理方法或化学方法来达到目地。

不同的实验室对于预处理也有自己独到的方法。

江翠翠等研究了不同物理机械与化学分散剂结合及加热与化学物质预处理土样对放线菌分离效果的影响，以期提高放线菌检出率。

采用涂布平板稀释法进行放线菌的分离，为达到更好的分散效果，物理机械分散常与化学分散相结合，促进微生物与土粒的分离。

范丽霞等对最有利于土壤放线菌分离的自然风干时间展开了研究。

研究结果表明：土样放置７天和２１天均适合放线菌的分离，放置７天的放线菌菌落较多，种类也较齐全，而细菌和真菌数量下降较快。

三株稀有放线菌的新种鉴定及分离菌株的活性初探
的开题报告
一、研究背景及研究意义
放线菌是一类广泛存在于各种环境中的细菌，其代谢产物具有多样
化的生物活性，因此受到了广泛的关注和研究。

随着现代分子生物学技
术的发展，越来越多的新种放线菌被鉴定出来。

然而，稀有放线菌的鉴
定与研究相对较少，且其代谢产物具有的生物活性也有待进一步探究。

本研究旨在鉴定三株稀有放线菌新种，分离其菌株并初步探究其代
谢产物的生物活性，旨在扩大放线菌新种鉴定及其代谢产物研究的广度
和深度，为药物研究开发提供新思路和新资源。

二、研究内容及方法
本研究预计采用以下方法进行：
1. 样品采集及处理：从自然环境中采集稀有放线菌样品，并进行初
步的筛选和鉴定。

2. 菌株的分离及鉴定：对于初步筛选出的稀有放线菌，进行分离和
鉴定。

通过形态学、生理生化等方法进行初步鉴定，以确立其分类地位
和鉴定新种。

3. 代谢产物的提取与分离：对鉴定得到的稀有放线菌进行发酵培养，提取其代谢产物，并进行分离纯化。

4. 生物活性的初步探究：对分离纯化得到的代谢产物进行生物活性
测试，包括抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等。

三、研究进度及预期成果
本研究预计在两年时间内完成。

第一年主要进行样品的采集、初步
筛选和鉴定、分离培养等工作；第二年主要进行代谢产物的提取和分离、生物活性初步测试等工作。

预期成果为确定三株新种稀有放线菌，分离得到多个菌株，提取分
离得到多个代谢产物，并对其进行生物活性初步测试。

为药物研究开发
提供新资源和新思路。

《四种荒漠珍稀植物根际土壤功能菌株的分离筛选及其促生作用研究》篇一一、引言荒漠生态系统因其独特的地理和气候条件，孕育了众多珍稀植物。

这些植物对荒漠地区的生态环境和生态平衡具有重要意义。

根际土壤中富含各种功能菌株，这些菌株在促进植物生长、改善土壤质量等方面具有重要作用。

本研究旨在从四种荒漠珍稀植物根际土壤中分离筛选出功能菌株，并探讨其促生作用。

二、材料与方法（一）研究区域及材料本研究所涉及的荒漠珍稀植物为红砂、紫云英、白刺和驼绒藜，均采集自我国西北荒漠地区。

所使用的实验材料包括土壤样品、培养基等。

（二）方法1. 土壤样品采集与处理：在四种荒漠珍稀植物生长区域，分别采集根际土壤样品。

对土壤样品进行无菌处理，去除杂质，进行后续实验。

2. 菌株分离与筛选：采用梯度稀释法、平板划线法等传统微生物学方法，从根际土壤中分离出功能菌株。

对分离出的菌株进行初步鉴定，筛选出具有促生作用的菌株。

3. 促生作用研究：通过测定菌株对植物生长的影响、对土壤性质的改善等指标，研究菌株的促生作用。

三、结果与分析（一）菌株分离与筛选结果经过对四种荒漠珍稀植物根际土壤的分离筛选，共获得数十种功能菌株。

经过初步鉴定，筛选出四种具有促生作用的菌株，分别为A1（红砂根际）、B2（紫云英根际）、C3（白刺根际）和D4（驼绒藜根际）。

（二）促生作用研究结果1. 对植物生长的影响：将筛选出的四种菌株分别与四种荒漠珍稀植物进行共培养实验。

结果显示，四种菌株均能显著促进植物生长，提高生物量。

其中，A1菌株对红砂的促生作用最为显著。

2. 对土壤性质的影响：通过测定土壤中有机质、全氮、全磷等指标，发现四种菌株均能显著改善土壤质量。

其中，A1菌株在提高土壤有机质含量方面表现最为突出。

3. 菌株生理生化特性分析：通过对四种菌株的生理生化特性进行分析，发现它们具有不同的酶活性、代谢产物等特性。

这些特性可能与它们的促生作用有关。

四、讨论本研究从四种荒漠珍稀植物根际土壤中成功分离出四种功能菌株，并研究了它们的促生作用。

两株放线菌次生代谢产物及生物活性的研究的开题
报告
题目：两株放线菌次生代谢产物及生物活性的研究
一、研究背景
放线菌是一类革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤中。

由于其特殊的代谢能力，能够合成各种次生代谢产物，并且具有各种生物活性，如抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤剂等。

因此，放线菌成为天然产物研究的主要来源之一。

本研究选择两株放线菌，从中筛选出具有生物活性的次生代谢产物。

二、研究目的
本研究旨在通过分离纯化两株放线菌的次生代谢产物，并对其生物活性进行研究，进一步开发和利用放线菌资源，为抗菌和抗肿瘤药物的开发提供新的合成材料。

三、研究内容和方法
1.菌种筛选
本研究选择两株具有重要生物活性的放线菌菌株，分别为Streptomyces lividans和Streptomyces griseus。

2.次生代谢产物提取
分别采用乙醇和乙酸乙酯提取两株放线菌的次生代谢产物。

3.孵育筛选
筛选出具有较强抗菌和抗肿瘤活性的产物，并进行进一步的分离纯化和鉴定。

4.生物活性测试
对纯化的次生代谢产物进行生物活性测试，包括抗菌、抗肿瘤和抗
氧化等。

5.结构鉴定
利用质谱、核磁共振等方法对产物进行结构鉴定。

四、研究意义
本研究对于发现新型生物活性物质，推动抗菌和抗肿瘤药物的开发，丰富天然产物资源，具有重要意义。

放线菌的分离与筛选方法放线菌（Actinomycetes）是一类革兰氏阳性细菌，常见于土壤和水体中。

由于其多样的形态和代谢特性，放线菌具有广泛的生物学和工业应用价值。

分离和筛选放线菌的方法是研究和利用其功能的基础，本文将介绍几种常用的方法。

一、分离方法：1.稀释和均匀涂布法：首先，将环境样品（如土壤、水样）进行适当稀释，并在培养基平板上平均涂布样品。

随着放线菌的生长，单个菌落会形成，然后可以通过挑选单个菌落进行分离纯化。

2.稀释和涂布法：方法类似于前者，但将初步培养得到的单菌落拖线在新的培养基平板上进行再次分离，以获得更纯的放线菌。

3.祛除污染菌法：样品前处理的关键是去除非放线菌细菌的干扰。

常见的处理方法有在分离培养基中加入抗生素、改变pH值等。

4.冷冻-融化法：利用放线菌对低温和高温的耐受性不同，将样品进行多次冻结-融化处理，可以选择性地分离出放线菌。

二、筛选方法：1.对抗菌活性筛选：放线菌具有对其他菌株的抗菌活性，可以使用对抗菌活性筛选方法，通过将待测分离物与感兴趣的致病菌共同培养，观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

2.抗真菌筛选：放线菌不仅对细菌有抑制作用，也能抑制真菌的生长。

可以通过共培养放线菌和待测真菌，并观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

3.溶磷筛选：放线菌具有溶解磷酸盐的能力，可以利用Na-P亚硝酸盐琼脂平板培养基来筛选放线菌。

4.产生生物活性化合物筛选：放线菌可以生成一系列生物活性化合物，如抗生素、酶、生物胺等。

可以根据需要设计相应的试剂盒，进行营养检测、酶活性测定或染色方法进行筛选。

5.双层平板筛选法：放线菌在液体培养基上生长一段时间后，将其转移到固体上层培养基上继续培养。

这种方法可以筛选出产生生物活性化合物的放线菌。

以上介绍的方法只是一小部分常用的放线菌分离和筛选方法，随着技术的不断发展，还有更多新的方法被提出。

分离和筛选放线菌是一个复杂且耗时的过程，需要根据具体的研究目的和条件来选择适合的方法。

云南大学学报(自然科学版),2007,29(1):86~89CN53-1045/N ISSN0258-7971 Journal of Yunnan University稀有放线菌的选择性分离方法彭云霞1,3,姜 怡1,2,段淑蓉1,李文均1,徐丽华1(1.云南大学教育部微生物资源重点实验室,微生物药物国家工程研究中心,云南省微生物研究所,云南昆明 650091;2.德国基尔大学海洋研究,D sternbroo ker Weg20,D-24105K iel;3.云南省出入境检疫局,云南昆明 650031)摘要:为了设计稀有放线菌的分离方法,对噬菌体S7,S3,重铬酸钾、萘啶酮酸、利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素、放线酮、制霉菌素等抑制剂及几种碳源进行了试验,设计或改良了几种培养基,研究它们分离稀有放线菌的效果.发现噬菌体能有效降低常见链霉菌的出菌率,重铬酸钾抑制真菌、细菌的效果好,M OPS、海藻糖、丙烯酰胺和乙二胺四乙酸能提高稀有放线菌的出菌率.推荐海藻糖-脯氨酸培养基、改良高氏2号、改良脯氨酸培养基作为稀有放线菌分离培养基.还提供了一些分离稀有放线菌的经验.关键词:稀有放线菌;分离方法;培养基中图分类号:Q93-331 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2007)01-0086-04放线菌是一类重要的微生物资源,它是抗生素及其他生物活性物质的主要生产者[1].几十年来,科研工作者发现,稀有放线菌能产生众多生物活性物质,包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等.其中一些抗生素已商业化,产生巨大的社会和经济价值.研究结果表明,环境中只有极少一部分微生物得到纯培养.因此,分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一.由于链霉菌已经大量被发现,排除已知链霉菌的干扰,也是设计分离程序要考虑的重要问题之一.一些实验室曾经在特定类群放线菌的分离方面进行过研究,但稀有放线菌的出菌率仍然偏低[2~5].本文报道稀有放线菌(系指链霉菌以外的放线菌)选择性分离方法研究的部分结果.1 材料和方法1.1 土样来源 土样于2004年2月采自中国云南省南部西双版纳地区、老挝和泰国等,包括热带雨林、常绿阔叶林、松林和混交林等多种生态环境,按照采样地点、生态环境,混合成1~10号样品,用于本实验.1.2 噬菌体 从德国天然产物化学研究所(H KI)获得2株噬菌体:S3和S7.1.3 抑制剂 硫酸庆大霉素100 g/mL,柱晶白霉素20 g/mL,利富平20 g/mL,制霉菌素100 g/mL,放线酮100 g/mL,重铬酸钾50 g/mL,萘啶酮酸20 g/mL.在海藻糖-脯氨酸培养基和改良高氏二号改良培养基中分别加入1种或2种抑制剂分别进行实验.1.4 分离培养基(1)几丁质培养基(1000mL,下同):几丁质2 g,K2HPO4 3H2O0.92g,KH2PO40.3g, MgSO4 7H2O0.5g,FeSO40.001g,ZnSO40.001 g,M nCl20.01g,琼脂20g,pH7.0.(2)土壤浸汁培养基:土壤浸汁1000m L (400g土壤,1000mL水,1 105Pa灭菌1h,过滤或离心,用上清液),蛋白胨5g,牛肉膏3g,琼脂20 g.(3)海藻糖-天门冬酰胺培养基:L-天门冬酰胺1g,海藻糖10g,K2HPO4 3H2O1.31g,微量盐1mL(FeSO4 7H2O0.2g,M nCl 2H2O0.1g, ZnSO4 7H2O0.1g,水100mL.),琼脂20g,pH 7.2~7.4.(4)海藻糖-脯氨酸培养基:海藻糖5g,脯氨收稿日期:2006-04-10基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2004CB719601);国家自然科学基金资助项目(30270004、30560001). 作者简介:彭云霞(1964- ),女,云南人,硕士生,主要从事放线菌分类方面的研究.酸1g,(NH4)2SO41g,NaCl1g,CaCl22g,K2HPO4 1g,MgSO4 7H2O1g,复合维生素(维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、p-氨基苯甲酸各0.5mg,生物素0.25mg,下同),琼脂20g,pH 7.2.(5)改良脯氨酸培养基:脯氨酸5g,琼脂20 g,pH7.2.(6)改良高氏二号改良培养基:葡萄糖1g,蛋白胨0.5g,胰胨0.3g,NaCl0.5g,琼脂1.5g,复合维生素,琼脂20g,pH7.2.1.5 分离方法 分别称取2g风干土样,120 干热预处理1h;冷却至室温后,加入准备好的Na4P2O7无菌溶液中,振荡30min后,再用50W 超声波处理1min,用无菌水梯度稀释(最终稀释1000倍),涂布于平板.为了试验噬菌体,取土悬液2mL到酵母膏-麦芽膏液体培养基中,28 预培养5h;把培养液分别稀释10倍后,加入噬菌体S3和S7.再37 培养30min后,培养液稀释,涂布平板.平板在28 培养,3~5周,菌落计数,挑菌,记录结果.1.6 菌种鉴定 以菌落形态观察为主,结合光学显微镜进行形态特征观察,同时参照Lechevalier 等[6]的方法分析细胞壁氨基酸的类型,将菌株鉴定到属.2 结果与讨论2.1 噬菌体的使用 实验结果表明,噬菌体对稀有放线菌的分离效果有比较显著的影响.在几丁质培养基上,未加噬菌体时,分离到链霉菌147株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的38.75%;加入100 L噬菌体S3和S7,分离到链霉菌78株,稀有放线菌110株,稀有放线菌占放线菌总数的58.51%;加300 L噬菌体时,分离到链霉菌44株,稀有放线菌76株,稀有放线菌占放线菌总数的63.33%;加500 L噬菌体时,分离到链霉菌43株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的68.38%.随着添加噬菌体数量的增加分离到的链霉菌的数量呈明显的下降趋势,当加入噬菌体的量增加到500 L时链霉菌的数量降低约70%,稀有放线菌所占比例几乎是未加时的1倍.S3-phag e是一类对S trep tomyces albus专一性的噬菌体,S7-phage是除了Str ep tomyces oli vaceus,对其它80多种链霉菌都具侵染力,而且裂解能力强[7].本实验结果表明它们能有效裂解链霉菌,相对提高了稀有放线菌的出菌率.利用噬菌体裂解链霉菌,结合使用其他选择性分离方法,用于分离稀有放线菌是切实可行的.但是有2点值得注意.第1,自然界仍然存在大量未知链霉菌,我们不清楚这2种噬菌体是否会裂解这些未知链霉菌;第2,我们也不清楚,加入噬菌体以后分离到的链霉菌是否已感染噬菌体,是否会危害未知链霉菌,因此,建议慎重使用噬菌体.2.2 抑制剂的选择 实验结果表明,利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素能有效抑制细菌的生长,但抑制真菌的效果较差,放线菌的出菌率也较低.本实验的结果表明,采用100 g/mL的放线酮或者制霉菌素和20 g/mL的萘啶酮酸,能有效抑制真菌和细菌,以达到分离较多的放线菌的目的.我们的实践多次证明,使用这一组效果良好的真菌、细菌抑制剂,几乎没有真菌的干扰,细菌也很少,对于分离稀有放线菌极有好处.同时,分离培养基加入50~75 g/mL重铬酸钾,可有效抑制真菌和细菌,而又不抑制放线菌,从而大大提高放线菌的出菌率.2.3 碳源的选择 碳源是培养基的基本成分,甘油、淀粉、葡萄糖、腐殖酸等已广泛应用于放线菌分离培养基.再使用这些碳源,常见放线菌的出菌率会很大.因此探索 稀有 碳源,用于稀有放线菌分离,是一条可试途径.吗啉丙磺酸(M OPS,morpho linepropanesulfonic acid)是一种中性缓冲剂(pH 6.5~7.9).使用海藻糖-脯氨酸培养基,用0.1%的MOPS作碳源(代替海藻糖,下同),共分离到放线菌336株,其中稀有放线菌169株,占50.3%;用0.2%的丙烯酰胺作碳源,分离到放线菌229株,其中稀有放线菌135株,占59.0%;用0.5%的海藻糖作碳源,分离到放线菌285株,其中稀有放线菌155株,占54.4%;EDTA也是一种中性缓冲剂(pH7.0~8.0)、螯合剂的代表性物质,能和碱金属、稀土元素和金属等形成极稳定的水溶性络合物,能使分离培养基维持中性环境,用0.2%的EDTA作碳源,分离到211株放线菌,稀有放线菌111株,占52.6%.因此,MOPS、丙烯酰胺、海藻糖和EDTA是分离稀有放线菌比较理想的碳源,稀有放线菌的出菌率都能超过50%,建议采用.吐温80(polyoxyethylenesorbitan monooleate or polysor87第1期 彭云霞等:稀有放线菌的选择性分离方法bate)和聚乙烯醇均可以作为乳化剂,增加土壤中部分难溶物质的溶解.用吐温80(0.5%)作碳源,分离到放线菌329株,其中稀有放线菌119株,占36.2%;用聚乙烯醇(0.2%)作碳源,分离到放线菌328株,其中稀有放线菌94株,占28.7%.十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,对非产孢类微生物有较强的杀灭作用.分离培养基加入对氨基苯甲酸(0.2%)、十二烷基硫酸钠(SDS, 0.2%)、鞣酸(0.2%)的培养基,没有任何放线菌生长,但可以降低浓度进一步试验.2.4 选择性培养基 从表1可以看出,3种分离培养基中,改良高氏二号(1.4(6))是营养贫乏培养基,各种成分均只有高氏二号培养基的1/10,又加了混合维生素和抑制剂.在营养贫乏的条件下,对稀有放线菌产生选择性分离效果.表1所列3种培养基中,改良高氏二号培养基分离效果最佳,不仅放线菌出菌率高(908株),而且链霉菌所占比例也小,稀有放线菌比例高达81%(733株).从海藻糖-脯氨酸培养基(1.4(4))分离到1096个菌株,稀有放线菌855株,占78%,其中有小单孢菌(Mi cromonosp or a,占25%)、指孢囊菌属(Dycty losp or angium)、链孢囊菌(Strep tosp orangium)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、小四孢菌属(Mi crotetr aspora)小双孢菌(M icrobisp ora)、双孢放线菌(A ctinobisp or a)、糖单孢菌(Saccharomonsp ora)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、诺卡氏类(Nocar dia)和未能鉴定到属的菌株,表现出明显的物种多样性.从改良脯氨酸培养基(1.4(5))分离到542株放线菌,其中稀有放线菌355株,占66%.使用几丁质培养基,虽然小单孢菌较多,但这类单调.使用土壤浸汁培养基,尽管加了抑制剂,但细菌污染较重,稀有放线菌出菌率不到5%.使用海藻糖-天门冬酰胺培养基,稀有放线菌的出菌率有24%,细菌污染少,是较好的培养基.在作稀有放线菌分离时,建议采用2种培养基: 改良高氏二号培养基; 海藻糖-脯氨酸培养基和改良脯氨酸培养基中选1种.表1 不同培养基对稀有放线菌的选择性分离效果T ab.1Effectiveness of selective isolation for rare act inomycetes o n different media 培养基土样1土样2土样3土样4土样5土样6总数R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R A/%(4)136149252255657181232105166175237855109678(5)610891635831118012516225235554266(6)374222622833731291608812422028173390881 R:稀有放线菌的数量;A:放线菌总数;培养基编号见文1.4;3种培养基均加50 g/mL的重铬酸钾Waksman发现链霉素以后,开启对放线菌的广泛研究,大量放线菌(尤其是链霉菌)被多次重复 发现 和描述.现在要发现新的放线菌是越来越困难了.但是从现代分子生物学的研究结果看,自然界实际存在的未知放线菌至少还有90%.因此不断设计新的简便、有效的分离程序,排除已知链霉菌干扰,分离未知稀有菌仍然是放线菌资源开发的关键之一.为此,我们建议:第1,不断改变培养基的成分(尤其是碳源的种类和量),设计新的培养基.以上3种培养基可以作为分离稀有放线菌之参考;第2,抑制剂的选择很重要,我们建议使用两组抑制剂:100 g/mL的放线酮或制霉菌素+ 20 g/mL的萘啶酮酸和50 g/mL的重铬酸钾,使用噬菌体要持慎重态度;第3,加入维生素混合物常常有利于稀有放线菌的生长.参考文献:[1] 姜成林,徐丽华.微生物资源学[M].北京:科学出版社,1997.[2] 李文均,张忠泽,姜成林.几种主要稀有放线菌的选择性分离[J].国外医药(抗生素分册),2002,23:18 22.[3] CHORM ON OVA N T.Isolation o f actinomadura fromsoil sample on selectiv e media with kanamycin and rifampicin[J].A ntibiotiki,1978,23:22 26.[4] WA KI SAK A Y,KA WAM U RA Y,YASIDA Y,et al.Aselective isolation pr ocedure for micromonospore[J].J Antibiot,1982,35:822 836.[5] SUZU K I S,T A KAHASHI K,OK U DA T,et al.Selective isolatio n of act inobispor e on gellan g um plates[J].88云南大学学报(自然科学版) 第29卷Can J M icrobio l,1998,44:1 5.[6] LECHEVAL IER M P,LECHEVAL IER H A.T hechemo tax onomy of actinomy cets [J ]//Actinomy cetes T axonomy.Ar lington:SIM Spec,Publ,1980,(6):277284.[7] K U RT BOK E D I ,CHEN C F ,W ILL IA MS S e ofpo lyvalent phage for reductio n of streptomycetes on soil dilution plates[J].J Appl Bacter iol,1992,72:103 111.Selective isolation methods of rare actinomycetesPENG Yun x ia 1,3,JIANG Yi1,2,DUAN Shu rong 1,LI Wen jun 1,XU Li hua1(1.T he Key L aboratory for M icrobial Resources of M inistry of Education,T he National Engineer ingCenter for Resear ch of M icrobial P harmaceuticals,Yunnan I nst itute of M icrobiolog y,Y unnan University,K unming 650091,China;2.Leibniz Institut f r M eeresw issenschaften an der Universit a ..t K iel,D sternbrooker Weg 20,D 24105Kiel,Germany;3.Quarantine Bur eau of Y unnan Province,Kunming 650031,China)Abstract :T o selecte isolation methods of rare actinom ycetes,the effects of various phages,inhibitors,car bon resoures were tested.Based on the tested results,several medium w ere desig ned and improved.Isolation ef fects of the medium w ere compared.The results indicate that trehalose Proline ag ar,modified Gauo s 2agar and proline agar are good medium for selective isolation for rare actinomycetes.Some experiences about isola tion of rare actinomy cetes were provided.Key words :rare actinomycetes;selective isolation methods;media *******************************简讯本刊入选 首届中国高校精品科技期刊2006年10月,在教育部科技司委托中国高等院校自然科学学报研究会组织开展的 首届中国高校精品 优秀 特色期刊评比活动 中,本刊入选中国高校精品科技期刊.此次评比共评出包括本刊在内的52种精品科技期刊,98种优秀科技期刊,100种特色期刊.本刊是西南4省区(川、滇、黔、桂)仅有的2家精品高校科技期刊之一(另1家是 四川大学学报(医学版) 。

1株土壤放线菌的分类鉴定及其抗菌活性的研究陈雪婷;郭婷婷;田威;何建勇【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(30)2【摘要】对从土壤微生物中筛选到的放线菌菌株1356进行分类学和抗菌活性的研究.采用多相分类法, 对菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rRNA 基因序列进行了研究.结果表明:该菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性为链霉菌属的特征;16S rDNA序列分析及系统进化树分析表明其序列与灰色产色链霉菌的同源性最高;该菌株的发酵产物对番茄叶霉、白色念珠菌、小麦根腐菌等17种真菌均有不同程度的抑制作用.放线菌1356菌株具有广谱抗真菌活性而对细菌无作用;初步确定其为链霉菌属灰色产色链霉菌的一个亚种.【总页数】4页(P68-71)【作者】陈雪婷;郭婷婷;田威;何建勇【作者单位】沈阳药科大学,生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学,生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016【正文语种】中文【中图分类】Q93-331【相关文献】1.海洋放线菌I10菌株发酵产物抗菌活性及其初步分类鉴定 [J], 方丽萍;龙建友;姬志勤2.9株土壤放线菌分离鉴定及抗菌活性 [J], 宋培勇;郑亚强3.两株红树林根际土壤放线菌的鉴定和抗菌活性研究 [J], 吴越;李小俊;陈建宏;蒋莲秀;何玉林;韦晗宁;孙承航;黄大林4.土壤放线菌P3-2的分类鉴定及抗菌活性研究 [J], 叶胜蓝;汪江峰;黄剑5.一株海洋放线菌的分类鉴定及抗菌活性研究 [J], 刘姝;陆兆新;吕凤霞;别小妹;房耀维;丁重阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。