放线菌筛选的一般方法定稿版

杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验从海洋或淡水体的污泥中分离水生放线菌，以鳗弧菌和肠型点状气单孢菌，这两种典型病害菌为指示菌，筛选杀菌放线菌，并初步鉴定。

1.指示菌：鳗弧菌和肠型点状气单孢菌中科院水生生物研究所提供大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验室保存种2.放线菌株分离纯化：从不同地区海洋或淡水体的污泥样品，取3g加入30mL无菌去离子水中，震荡20-30min，梯度稀释至10-2、10-3、10-4 ，涂布于高氏1号平板（培养基中加入0.0075℅重铬酸钾，抑制细菌和真菌），28℃培养7d.挑不同形态的单菌落到高氏1号斜面培养，将菌落在平板上反复划线纯化得纯培养物，4℃冰箱保存。

分离出86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。

3.放线菌株的筛选：3.1初筛：将纯化菌株接种于改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养8d.用无菌钻孔器打成5mm的琼脂块。

取指示菌0.1ml涂布于普通琼脂平板，挑取打好的放线菌琼脂块反贴到已涂指示菌的平板上，鳗弧菌和肠型点状气单孢菌在28℃培养，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。

琼脂扩散法抑菌试验表明：19株淡水放线菌具有抑菌活性，32株海洋放线菌具有活性，故海洋放线菌产生抗菌物质比例高。

对初筛活性强的7株海洋和3株淡水放线菌加入复筛。

3.2复筛：有较强抗菌能力的放线菌接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃140r/min培养8d，取指示菌0.05ml涂布于普通琼脂平板，用无菌打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05ml注入孔中，培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。

获得较好的海洋放线菌4株，淡水放线菌2株，其抗菌活性测定结果表：六株放线菌抗菌活性测定结果（抑菌圈直径） mm鳗弧菌肠型点状大肠杆菌金黄色葡菌株产气单胞菌萄球菌1 18 17 15.5 19.52 18 18 16 183 15 15 16 184 10 8 -（无抗） 165 13 14 - 14.56 15 15 - 184.六株放线菌的初步鉴定：4.1形态和培养特征观察：分别接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 7 15 30d，取出插片，观察气生菌丝（包括颜色，是否产色素）基内菌丝（包括颜色，是否产色素）是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，取成熟期的特征作为分类依据。

放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。

2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。

将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。

3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。

液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。

4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。

常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。

其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。

5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。

可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。

6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。

结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。

7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。

在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。

综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。

这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。

212 热处理对可培养放线菌和细菌数量的影响 在同样的处理时间下 , 随着预处理温度升高 , 放线菌数量和种类均明显增加 , 细
菌数量有减少趋势 , 说明通过一定温度预处理有利于放线菌孢子萌发 , 对细菌生长有 一定抑制作用 (表 3) 。如 1 号土样经 110h ×120 ℃处理后放线菌数量 (719 ×106 个Πg) 和种类 (18 种) 较 110h ×100 ℃处理的放线菌数量 (711 ×106 个Πg) 和种类 (15 种) 分 别增加了 10 %和 20 %。相同温度处理下 , 随着处理时间延长 , 放线菌数量和种类均呈 现先升高 、后降低的趋势 , 细菌数量稍有减少 。如 120 ℃下 , 1 号土经 110h , 115h 及 210h 处理后放线菌数量 ( ×106 个Πg) 分别为 719 、714 及 511 , 120 ℃×210h 处理下的放 线菌数量分别比 120 ℃×115h 和 120 ℃×110h 处理降低了 55 % 和 45 % , 即处理时间过 长会导致放线菌数量减少 。因此 , 在分离放线菌前 , 采用适当的温度和时间对土样进 行预处理可使放线菌孢子活化 , 以便获得更多放线菌 。但热处理对减少细菌的出菌量 效果不理想 , 其结果与姜成林[9] 的研究一致 。
2004 年 31 (2) 微 生 物 学 通 报
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放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究
司美茹 薛泉宏 3 来航线
(西北农林科技大学资源环境学院 杨凌 712100)
摘要 : 采用平板涂抹分离法研究了培养基种类 、土壤样品加热预处理及化学抑制剂对放线菌分 离效果的影响 。结果表明 : 高氏 1 号琼脂培养基 ( GA) 和秸秆腐解物琼脂培养基 (SDSA) 的分 离结果可以反映土壤中放线菌的基本状况 ; 120 ℃×110h 加热预处理土样能促进放线菌孢子萌 发 , 增加放线菌的分离数量和种类 。供试土样经 120 ℃×110h 加热预处理后放线菌的数量和类 型较对照处理分别增加了 515 %～5419 %和 1215 %～100 % , 但加热处理对减少细菌数量作用不 明显 ; 在放线菌分离培养基中同时加入 K2 Cr2O775μgΠmL 与 1～3μgΠmL 青霉素 , 细菌数量减少 , 1 号土样在 SDSA 培养基上放线菌数量 ( ×106 个Πg) 和种类 (种) 分别较仅加入 75μgΠmL K2 Cr2O7 处理减少 0～5818 %和 0～1812 % ; 链霉素不能用作分离放线菌时的细菌抑制剂 。 关键词 : 放线菌 , 微生物资源 , 放线菌分离 , 培养基 中图分类号 : Q931331 文献标识码 : A 文章编号 : 025322654 (2004) 0220061205

• 2.3菌株发酵滤液的拮抗性测定 选择初筛拮抗效果较好的放线菌进行液体发酵培养， 利用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定菌株 • 发酵滤液对不同病原菌的拮抗作用。 （1）发酵滤液的制备 将孢子浓度为108个/mL的放线菌接种到液体发酵培 养基中，于28℃，200 rpm/min摇床中恒温培养，5 d 后取发酵液于4500 rpm/min条件下离8min，上清液经 微孔滤膜过滤，得发酵滤液。 （2）抑制菌丝生长速率法测定滤液的拮抗作用 取1mL发酵滤液与9mL融化的PDA培养基充分混匀， 倒入无菌培养皿中制成带药平板。待培养基凝固后， 在板中央接入一直径为7 mm的病原菌菌饼（带有菌丝 的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加 1mL蒸馏水的PDA平板为对照。培养5d后，十字交叉 法测量供试病原菌菌落直径，通过下述公式计算抑制 率
• 1.4 主要仪器 BCD-265冰箱 FA2004N电子天平 pH S-3C酸度计 TGL-16G型高速台式离心机 YXQ-L31-400蒸汽灭菌锅 GRP-9050隔水式恒温培养箱 DL-CJ-2N高性能无菌实验台 HZQ-Q全温振荡器 QL-901旋涡混合器
• 2.方法 • 2.1土壤中放线菌的分离、纯化 • （1）土样的预处理 将采集到的土样自然风干，按1：10的比 例加入碳酸钙，28℃培养箱内放置5-7d。 • （2）土壤悬浮液的制备 研钵研磨预处理的土壤样品至颗粒均匀。 称取1g土样加入装有l0mL无菌水的试管中， 充分震荡10min，制成浓度为10-1的土壤稀 释液。吸取1mL上清液，加到装有9mL无菌 水的试管中震荡成10-2的稀释液。依照同种 方法制备浓度分别为10-3、10-4、10-5的土 壤稀释液。
• （3）管碟法测定滤液的拮抗作用 培养好的病原菌制成一定浓度的菌悬 液，与适量PDA培养基充分混匀，倒入 无菌培养皿内制成带菌平板。待培养基 凝固后，在板的中央放置1个牛津杯，加 入0.2mL发酵滤液，每个处理重复3次。 以加蒸馏水的PDA平板为对照。置28℃ 恒温箱中培养，5 d后利用十字交叉法测 量抑菌圈直径。 结合初筛及发酵滤液对病原菌的拮 抗试验，确定目的菌株。

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。

腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。

放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。

1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。

如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。

可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。

选择抑制活性强的复筛。

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。

若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。

若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。

1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。

2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。

（1）取体积为300ml的高氏一号培养基，加入0.1%的重铬 酸钾15mL，使之终浓度为50ppm，摇匀，倒平板，待用。
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中 120℃干热处理1h。
（3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠 的三角瓶中，加入0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟， 静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土 样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
实验一 放线菌的选择分离与计数
一 教学要求
放线菌有多种代谢产物，如抗生素，维生素、氨基酸、 蛋白质、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，很多产物在农业、 医疗、食品及国防等领域产生了巨大的效益。
本实验的目的在于学习从土壤等环境中分离放线菌
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二 实验原理
土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链 霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、 诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但 往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离 方法很难得到。对样品进行风干、干热处理、培养基 添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；用干热 和苯酚处理减少链霉菌数量的方法，可以分离得到更 多种类的放线菌。
（2）注意在培养基中添加重铬酸钾适量
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六 思考题
请设计一种分离稀有放线菌的实验方案
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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三 材料与器材
菜园土或林地土，自然风干，备用。 0.1％ 重铬酸钾溶液，1％ 苯酚，高氏1号
培养基。 水浴锅等。
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四 操作步骤
取样及预处理
1、来源：土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。 从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线 菌，从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。

放线菌的筛选、分离与鉴定姓名：王国兴学号：xs139003放线菌在自然环境中分布广泛，存在于不同生态环境中，种类繁多，代谢途径多样，是一类用途广泛的生物资源。

在已经发现的抗生素中，有80%的抗生素来自于放线菌，因而放线菌愈来愈得到人们的重视和利用。

过去由于技术的制约，用形态特征、理化特性、菌体某些化学成分等方法分类及鉴定菌株，至今任然沿用，但是方法存在局限性。

近些年来，得益于分子生物学的快速发展，使放线菌的应用前景不可限量。

通过分子生物学实验技术，我们可以对放线菌进行细致的分类。

目前分类方面一般采用的做法是除了需要形态观察、培养特征、生理生化实验外，还要进行核酸序列或氨基酸序列的测定，其中相当有效的分类鉴别方法之一是采用PCR扩增16S rDNA进行序列分析。

对16S rDNA进行研究，一般的步骤是：（1）提高基因组DNA;（2）用λ噬菌体制备鸟枪DNA文库;（3）用16S rDNA特异性探针性筛选;（4）从含有16S rDNA的克隆中进行测定；（5）比较、分析序列。

本文将为大家介绍一类放线菌的筛选、分离与鉴定的方法。

1.材料采集样品，用高氏一号培养基（高氏一号培养基：可溶性淀粉2.0%、KNO3 0.1%、K2HPO4 0.05%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.001%、重铬酸钾0.01%，用海水1000mL配制，调节其pH7.2~7.4；医用抗生素药敏纸片、培养皿、载玻片、盖玻片等。

）或燕麦琼脂( ISP－3)（燕麦粉20.0g，微量盐溶液1.0ml，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH7.2）或放线菌发酵培养基（葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，糖蜜5g，干酵母2g，碳酸钙3g，蒸馏水1.0L）或LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1.0L，pH7.0）或PDA培养基（马铃薯浸提液500ml，葡萄糖10g，琼脂7.5g）进行培养。

微生物总数检测方法(放线菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基：高氏1号培养基配方：可溶性淀粉 2g ，KNO30.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4• 7H2O 0.05g ，NaCl0.05g ，FeSO4• 7H2O 0.001g （母液），琼脂 2g ，自来水 100mL 。

先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。

在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。

调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

2. 培养条件：温度：27℃-30℃；时间：36--48小时。

二、检测与计数方法1. 系列稀释称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。

2. 用1mL无菌移液管分别吸取1.0mL上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。

3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。

此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。

4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。

当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

5. 菌落计数以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。

有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。

抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG—3A1鉴定1材料与方法1.1材料1.1.1病原菌尖孢镰刀菌4号生理小种，由中国热带农业科学院生物技术研究所曾会才实验室提供。

1.1.2主要培养基内生放线菌分离培养基采用改良高氏（Gauses）1号培养基（GS）、1/10 ATCC 合成培养基、葡萄糖天门冬酸培养基（GA）、腐殖酸培养基（HV）、改良高氏2号培养基（GPT）和改良淀粉酪素培养基（SIM）[14-18]，为抑制杂菌生长，在各分离培养基中均加入终浓度为75 mg/L的重铬酸钾、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸；放线菌纯化培养保存采用YE培养基；抑菌试验采用马铃薯琼脂培养基（PDA）；液体发酵采用淀粉-大豆粉液体培养基；形态特征观察采用国际链霉菌计划（ISP）推荐的培养基，参考Shirling等的方法[19-20 ]进行配制。

1.1.3样品采集与处理2012年11月3日从海南省临高南宝蕉园（19°47′1″N，109°51′17″E）和皇桐蕉园（19°49′58″N，109°50″E）采集香蕉植株样品（表1）。

每个品种随机采集香蕉植株10株，混匀。

表1样品采集信息采集地点根部土壤pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美台蕉园4.35农科健康植株（NK）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17南天健康植株（NJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54南天感病植株（NB）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17巴西健康植株（BJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54巴西感病植株（BB）根、球茎、假茎、叶1.2方法1.2.1内生放线菌的分离参考阮继生分离弗兰克氏菌的方法对样品进行表面消毒，采用组织块匀浆法进行内生放线菌分离。

1.2.2香蕉枯萎病内生拮抗放线菌筛选以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，采用平板对峙法进行初筛；对初筛有活性的菌株用平板对峙法进行复筛，计算抑菌率，公式为：抑菌率=[（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径]×100%。

一、实验题目：分离放线菌。

二、实验原理：土壤中放线菌最丰富，品种齐全。

通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。

土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。

用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释涂布平板法法来获得放线菌。

稀释涂布平板法：取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布波棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。

三、实验材料及器材（1）实验材料：采集的土壤材料。

材：微波炉、电磁炉、干燥箱、玻璃涂铲、50或100mL量筒（灭菌）、90mm培养皿（灭菌）、1或2mL移液管（灭菌）、标签纸、小玻璃珠（灭菌）、吸耳球，盖玻片等。

（3）实验试剂：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、琼脂、盐酸、氢氧化钠、PH试纸、重铬酸钾。

四、实验步骤（一）采样1、放线菌的特点、生境分析放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤，每克土壤内含有数万、数十万的孢子。

放线菌的孢子和孢囊孢子在适宜的环境下吸收水分，膨胀萌发，生出芽管1 － 3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。

因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。

基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。

基内菌丝体向空间长出的菌丝体叫做气生菌丝体。

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。

腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。

放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。

1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。

如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。

可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。

选择抑制活性强的复筛。

1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。

若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。

若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。

1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。

2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。

2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。

产抑菌活性物质放线菌菌株的筛选张煜玲;张利平;石楠【摘要】[ Objective ] The research aimed to screen strains of actinomycetes with antibacterial activity. [ Method ] 300 strains of actinomycetes with antibacterial activity which isolated and stored in Key Lab of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province were screened by filter paper method, using Staphyloccocus aureus, penicillin and eephalosporin-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli.As the indicators, and the minimum inhibitory concentration (MIC) of the positive strains were detected. [ Result ] 111 strains with antibacterial activity were selected, and the rate of inhibition was 37.0％. The amount of strains with inhibit activity for Staphyloccocus aureus, Escherichia coli. and resistant Staphyloccocus aureus was 111,10 and 40, respectively. The minimum inhibitory concentration of the strain was far different from each other, strain 174883 showed the strongest antibacterial activity against Staphylococcus aureus, and its fermentation were diluted to 2 048 times still showed antibacterial activity. With penieillinase and cephalosporinase treatment, the antibacterial activity of six strains became weak. The antibacterial activity of strain 32349 andkj0428 were inhibited obviously among all strains. [ Conclusion ] The positive actinomycetes strains screened have good antibacterial activity. This result could provide basis for the soreening of new type antibiotics.%[目的]筛选产抑菌活性物质的放线菌菌株.[方法]以金黄色葡萄球菌、对青霉素和头孢菌素类耐药的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌,采用滤纸片扩散法对300株放线菌的发酵产物进行抗菌活性筛选,通过最小抑菌浓度法(MIC)时筛选的阳性菌株进行抗菌活性测定.[结果]筛选到抗菌活性物质产生菌111株,抑菌率为37.0%;其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和耐药金黄色葡萄球菌有抑制活性的菌株分别为111、10和47株.各菌株的最小抑菌浓度有很大差别,菌株174883对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,其发酵样品稀释到2048倍仍然表现出抑菌活性.用青霉素酶和头孢菌素酶作用于阳性菌株发酵产物,筛选到6株菌株代谢产物的抑菌活性变弱,菌株32349和kj0428的抑菌活性被抑制最明显.[结论]筛选得到的阳性放线菌菌株具有良好的抗菌活性,为新型抗生素的筛选提供了研究基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)012【总页数】4页(P6971-6974)【关键词】放线菌;抑菌活性;筛选【作者】张煜玲;张利平;石楠【作者单位】河北大学生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用实验室,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】R978.1放线菌在自然界中分布广泛，是产生抗生素活性物质最大的一类微生物。

菌种筛选的一般步骤________、_________、________。

答案：菌种的分离和筛选一般步骤分为采样、富集、分离、目的菌的筛选四个步骤。

知识拓展：
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中。

分离和纯化土壤中放线菌的实验流程如下：土壤取样→系列稀释→涂布平板→恒温培养→观察菌落→菌种纯化。

回答下列问题：（1）取样时应选择有机物含量丰富且疏松的土壤，可判断大多数放线菌属于____（填“需氧菌”或“厌氧菌”）。

将1g土样放入盛有99mL无菌水的锥形瓶中混合均匀，再取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，则该试管中稀释液的稀释倍数为____倍。

（2）高氏1号培养基是培养放线菌的常用培养基，该培养基含有的营养物质主要包括____。

（3）在分离土壤中的放线菌时，为减少细菌和真菌的干扰，提高放线菌的分离效率，在培养基中要加入一定量的重铬酸钾，重铬酸钾在培养基中所起的作用是____。

（4）放线菌的培养温度一般应____（填“低于”或“高下”）细菌的培养温度。

（5）筛选放线菌可根据菌落特征进行判断，菌落特征主要包括____（答两点）等方面。

（6）分离得到土壤中的放线菌后，可利用____法对菌种进行纯化。

答案：(1). 需氧菌(2). 103（或1000）(3). 碳源、氮源、水和无机盐(4). 抑制细菌和真菌的生长（或选择作用）(5). 低于(6). 形状、大小、颜色和隆起程度(7). 平板划线或稀释涂布平板。

实验论文土壤中产抗生素放线菌的筛选及抗菌谱的测定作者：天奇6666662017 年06 月目录摘要 (3)1、引言 (4)2、实验材料与方法 (4)2.1材料 (4)2.1.1 土壤样品 (4)2.1.2 培养基 (4)2.2 实验方法及步骤 (5)2.2.1 放线菌的分离及最佳土壤稀释浓度的选择 (5)2.2.2放线菌纯化培养 (5)2.2.3 保存备用菌株 (5)2.2.4 供试菌液配置 (5)2.2.5进行拮抗试验 (5)3、实验结果与分析 (6)3.1实验结果表（表二） (6)3.2实验照片 (6)3.3实验结果分析 (7)4、结论与讨论 (7)4.1结论 (7)4.2讨论 (7)5、参考文献 (8)摘要本次实验选取了学校八个采样点进行采样，通过土壤悬液稀释进行固体培养基涂布培养，分离纯化出对其他微生物有拮抗作用的放线菌，使用牛肉膏蛋白胨固体培养基和PDA培养基进行抗菌谱测定。

本次实验以双管齐下的方式分别进行主实验与次实验，保证了实验重复性并极大节省了时间，实验过程分两批进行，主实验通过培养细菌与真菌菌液，涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分离出了五珠无拮抗作用的放线菌，次试验通过点接的PDA培养基的方式分离出一株对枯草芽孢杆菌有抗性而对黑曲霉有轻微抗性的放线菌菌珠。

关键词：土壤、放线菌、拮抗作用1、引言土壤----作为生物生存一种基本的资源，其中蕴藏着巨大的微生物资源，特别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌，研究土壤沉积微生物，不仅可以发现新的放线菌资源，同时也可能发现新型活性产物，在医药、食品、化工、环保等行业意义巨大。

放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物, 目前从微生物中发现的大约 8 000 种生物活性物质中, 近 70 % 是由放线菌产生的。

放线菌是一群革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% ) 的细菌。

放线菌因菌落呈放线状而的得名。

它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。

放线菌筛选的一般方法放线菌筛选是一种从大自然中寻找新的抗生素和其他有用化合物的方法。

放线菌是一类革兰氏阳性细菌，与其他细菌存在显著区别，它们具有许多生物活性代谢产物的天然合成能力。

因此，放线菌筛选被广泛应用于寻找新的抗生素和其他有活性的化合物。

1.采集样本：首先，需要在大自然环境中采集到放线菌的样本。

放线菌广泛分布于土壤、水体、植物等各种环境中，因此可以从这些环境中采集到样本用于筛选。

样本的采集可以通过在目标环境中收集土壤或其他样品，并将其置于合适的容器中保存。

2.预处理：采集到的样本通常含有大量不同种类的微生物，因此需要进行预处理步骤。

预处理的目的是去除其他微生物，只留下放线菌。

常用的预处理方法包括加热处理、酸碱处理、稀释等。

3. 筛选培养基的选择：放线菌的生长需要适宜的培养基，因此在筛选之前需要选择合适的培养基。

常用的培养基包括Mannitol-Soya agar （MSA）、Glycerol Yale agar（GYA）、Starch Casitone-Nitrate agar （SCN）等。

4.筛选培养条件的优化：放线菌的生长条件可以通过培养条件的优化来改善。

常用的优化参数包括温度、pH、培养时间和培养基成分等。

优化培养条件可以提高放线菌生长的速度和产生生物活性物质的能力。

5.放线菌分离：在筛选培养基上，可以观察到放线菌的集落。

这些集落可以单独分离，得到纯种的放线菌菌株。

分离放线菌的常用方法包括传代分离和扩散板法等。

6.放线菌菌株的筛选：得到纯种的放线菌菌株后，可以进行生物活性物质的筛选。

常用的筛选方法包括抗菌活性测定、抗肿瘤活性测定和酶活性测定等。

这些方法可以通过测量抑菌圈直径、细胞生存率和酶催化能力来评估放线菌菌株的活性。

7.活性物质的提取和纯化：经过筛选得到有活性的放线菌菌株后，还需要将其产生的活性物质进行提取和纯化。

常用的提取方法包括溶剂提取法、胶体微滤法和萃取法等。

而纯化方法则包括柱层析、薄层层析和高效液相层析等。

放线菌筛选的一般方法（1）•相关推荐放线菌筛选的一般方法(1)放线菌筛选的一般方法摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。

放线菌是革兰氏阳性细菌。

因菌落呈放线状而的得名。

常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。

由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。

关键词：放线菌筛选微生物1 放线菌的情况放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。

因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。

大多数有发达的分枝菌丝。

菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。

可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。

是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。

放线菌因菌落呈放线状而的得名。

放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。

一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。

弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。

此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。

少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。

因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。

放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。

放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。

土壤特有的.泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。

它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。

与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。

放线菌的分离与筛选方法放线菌（Actinomycetes）是一类革兰氏阳性细菌，常见于土壤和水体中。

由于其多样的形态和代谢特性，放线菌具有广泛的生物学和工业应用价值。

分离和筛选放线菌的方法是研究和利用其功能的基础，本文将介绍几种常用的方法。

一、分离方法：1.稀释和均匀涂布法：首先，将环境样品（如土壤、水样）进行适当稀释，并在培养基平板上平均涂布样品。

随着放线菌的生长，单个菌落会形成，然后可以通过挑选单个菌落进行分离纯化。

2.稀释和涂布法：方法类似于前者，但将初步培养得到的单菌落拖线在新的培养基平板上进行再次分离，以获得更纯的放线菌。

3.祛除污染菌法：样品前处理的关键是去除非放线菌细菌的干扰。

常见的处理方法有在分离培养基中加入抗生素、改变pH值等。

4.冷冻-融化法：利用放线菌对低温和高温的耐受性不同，将样品进行多次冻结-融化处理，可以选择性地分离出放线菌。

二、筛选方法：1.对抗菌活性筛选：放线菌具有对其他菌株的抗菌活性，可以使用对抗菌活性筛选方法，通过将待测分离物与感兴趣的致病菌共同培养，观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

2.抗真菌筛选：放线菌不仅对细菌有抑制作用，也能抑制真菌的生长。

可以通过共培养放线菌和待测真菌，并观察是否产生抑菌圈来筛选放线菌。

3.溶磷筛选：放线菌具有溶解磷酸盐的能力，可以利用Na-P亚硝酸盐琼脂平板培养基来筛选放线菌。

4.产生生物活性化合物筛选：放线菌可以生成一系列生物活性化合物，如抗生素、酶、生物胺等。

可以根据需要设计相应的试剂盒，进行营养检测、酶活性测定或染色方法进行筛选。

5.双层平板筛选法：放线菌在液体培养基上生长一段时间后，将其转移到固体上层培养基上继续培养。

这种方法可以筛选出产生生物活性化合物的放线菌。

以上介绍的方法只是一小部分常用的放线菌分离和筛选方法，随着技术的不断发展，还有更多新的方法被提出。

分离和筛选放线菌是一个复杂且耗时的过程，需要根据具体的研究目的和条件来选择适合的方法。