Caspase

Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。

本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。

其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。

若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。

所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。

应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。

一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。

当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。

依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。

• 细胞计数，离心收集细胞。

以PBS缓冲液洗涤一次。

若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。

Caspase家族Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。

Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。

由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。

Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。

线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。

线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。

人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE （interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b切割下来。

在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。

进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。

Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。

Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。

摘要内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。

人血管内皮细胞（EC）营养剥夺引起的非常规分泌导致nanovesicles不同于凋亡小体的多泡体标记和承载释放形式（MVB）。

营养的缺乏也是一个有效的诱导的自噬小泡运输途径可以帮助细胞自噬。

营养缺乏引起的一个显着和自噬功能的迅速增加，通过电子显微镜和免疫印迹分析LC3-II / LC3-I比成像。

增加自噬通量在血清饥饿细胞巴弗洛霉素A确认1。

诱导的自噬后的凋亡反应的指标，如通过显微镜和聚（ADP-核糖）评估在细胞膜通透性的指示坏死缺失聚合酶裂解。

与zvad-fmk泛caspase抑制并没有阻止细胞自噬的发展而受到负面影响自噬泡（AV）成熟。

采用免疫印迹法验证多维蛋白质组学的方法，我们确定营养剥夺EC释放AV组件（lc3i，LC3-II，ATG16L1和LAMP2）而zvad-fmk 泛caspase抑制剂阻断AV释放。

同样，在主动脉的小鼠EC营养剥夺的分离研究/半胱天冬酶3-缺失的小鼠没有凋亡自噬LC3和未能迅速释放。

总的来说，本研究结果表明，自噬成分释放的营养剥夺细胞凋亡的人类细胞的细胞膜通透性的缺失。

这些结果也确定caspase-3作为一种新型的AV释放器。

关键词自噬，自噬，caspase的激活，caspase-3，营养剥夺，非常规分泌说明内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。

响应于各种细胞应力是免疫或非免疫内皮细胞凋亡是血管疾病最关键。

凋亡细胞的凋亡小体膜结合主动释放来自皱缩，细胞膜。

1，2我们最近证明，除了膜起泡，非常规形式的分泌在人类凋亡激活的内皮细胞（EC）导致纳米囊泡的生化和功能不同的凋亡小体的多泡体标记和承载释放（MVB）。

3泛半胱天冬酶失活或小干扰靶向研究显著降低凋亡细胞释放的MVB成分RNA。

然而，MVB成分释放被描述在一个实验中，在人类EC敏锐地剥夺生长因子，一个经典的促凋亡刺激，但也是一种有效的诱导细胞自噬。

Caspase生化特性caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶，一般在细胞内以无活性酶形式存在；当其作用于特异性底物，产生异二聚体，同时发出光子。

Caspase检测凋亡的原理通过检测细胞内caspase酶活性了解细胞的凋亡功能。

试剂渗透进入细胞后，使细胞内caspase 酶释放，作用于其特异性底物，产生发光体或荧光，发光酶（荧光酶）作用于发光体，产生光。

发光度与细胞内caspase酶活性成正比。

Caspase酶活性反映了细胞内凋亡途径激活情况，即细胞的凋亡能力。

如何做对照组？阴性对照：caspase抑制剂和培养基；或者只加完全培养基。

试剂盒没有caspase抑制剂？不必要。

Caspase试剂盒组成：caspase3/7特异性底物；含发光酶，细胞溶解液的缓冲液。

Caspase试剂盒分类：caspase3/7,caspase8,caspase9.(后两个是内源性凋亡途径参与物）试剂盒的选择：一般细胞凋亡检测选用caspase3/7试剂盒，如果用于分析凋亡上游启动子，根据对凋亡途径（内源性/外源性）的兴趣，选择caspase8/caspase9试剂盒即可。

Caspase3/7介绍Caspase3/7是一种发光分析法，可用于检测粘附细胞或悬浮生长细胞内caspase3/7的酶活性。

试剂盒中包含了发光前体caspase3/7的Z-DEVD-aminoluciferin 冻干底物，DEVD为抑制剂，保证了试剂盒的特异性。

底物被切割后产生发光体，发光体作为发光酶的底物与之反应后，发出光。

Caspase3/7试剂已经对caspase酶活力，发光酶活力以及细胞溶解做了优化。

将试剂以混合物形式加入样本，导致细胞溶解，底物的切割和产生流性光信号。

可用于研究细胞凋亡和凋亡抑制。

实验大概需用2小时一轮。

检测波长一般检测发光体没有内置的波长选择功能，都采用全部可见光检测。

原因有二：1.不需用滤光；2.滤光后敏感度降低。

内源性凋亡途径：病毒，紫外线或线粒体胞膜破坏，细胞色素C释放至胞液等因素导致内源性凋亡途径激活，从而产生含有caspase-9前体的凋亡小体复合物，复合物导致caspase-9活化，接着caspase-9使下游介导凋亡的死亡效应caspase酶活化，包括caspase3,caspase6,caspase7。

Caspase 3 活性检测试剂盒产品组成：产品组成 BB-4106-1 BB-4106-2 BB-4106-3规格 20 assays 50 assays 100 assays 裂解缓冲液 5ml 10ml 15mlAc-DEVD-p NA 200ul 500ul 1ml检测缓冲液 5ml 10ml 15mlDTT 100ul 150ul 250ul产品简介：Caspase 3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。

Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。

Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。

Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase 底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。

这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。

另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。

同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。

本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。

细胞死亡机制中caspase的作用研究细胞死亡是生命中不可避免的一环，细胞死亡机制的研究一直是人类生命科学领域重要的课题之一。

在细胞死亡机制中，caspase起到了至关重要的作用。

Caspase是细胞内的一类酶，是重要的细胞凋亡信号传递酶，也是细胞死亡过程中最具活性的蛋白酶。

Caspase在细胞凋亡和其他细胞死亡方式中发挥着重要作用，例如，坏死、剥落及程序性坏死等。

在大多数细胞死亡过程中，细胞内外环境的变化能引起caspase 的激活。

激活后，caspase能够与细胞自身蛋白酶底物结合并切割其蛋白质结构。

这些底物包括细胞骨架蛋白、DNA修复蛋白、转录因子、RNA聚合酶等，其切割会触发一系列生物学反应，并引起细胞死亡。

caspase是一类特定的蛋白酶，它是由某些发生细胞凋亡反应的信号分子调节激活的。

所以也叫做凋亡蛋白酶。

caspase是一个切割酶，它切断细胞内许多蛋白质。

caspase在AOI和细胞凋亡中对细胞的分解、消失起着重要的作用。

caspase的功能涉及到细胞凋亡、炎症反应、免疫应答等诸多生物学过程。

在正常的生理过程中，caspase是保持细胞稳态的重要因子，在异常情况下，如病原微生物的感染、肿瘤细胞的增殖等，caspase发挥着重要的防御作用。

研究表明，caspase的存在对于一些生物过程是必须的。

例如，在胚胎发育过程中，caspase能够帮助细胞完成正常的凋亡过程、促进组织的正确建立以及保证细胞数量的恰当分布。

再如，在神经系统中，caspase的作用能够帮助神经元在机体受损后产生凋亡、分泌出神经营养因子以及调节神经元突触可塑性，从而帮助机体适应外界环境变化。

总之，在生物体内，caspase不仅仅是细胞死亡的执行者，同时也是组织细胞生存与成长的关键过程。

总之，在细胞死亡机制中，caspase起着极其关键的作用，它作为细胞凋亡的关键调节元素和最具活性的蛋白酶，能够帮助维持细胞稳态、促进组织正常建立以及适应外界环境变化等人体重要过程。

caspase名词解释caspase是由宿主细胞系统产生的一类酶，它被广泛用于细胞凋亡的调控。

随着研究的深入，caspase的功能也变得越来越清晰。

首先，caspase是一类重要的半胱氨酸酶，它们主要存在于动物细胞中。

它们可以通过识别和切割细胞膜上的某些蛋白质来活化，从而实现细胞凋亡过程的自动化、控制和引导。

caspase蛋白最初由周恩来等研究人员发现，目前已经被发现的caspase有13种，包括caspase-1、caspase-3、caspase-4、caspase-8、caspase-9等。

此外，caspase在细胞凋亡过程中也起着重要的作用。

当细胞受到刺激，如特异性蛋白、应激、细胞伤害等，细胞内的信号传导会被激活，触发caspase的活化，开启细胞凋亡的程序。

当caspase活化后，他们会通过切割转录因子、细胞膜蛋白和胞质蛋白等大量基因产物，来调节细胞凋亡过程并使其有序进行。

caspase在许多器官系统中扮演着重要的角色，它不仅可以控制细胞正常繁殖，还可以促进细胞存活能力，保护细胞免受某些外界刺激。

在心脏、脑、肝脏等器官系统中，caspase蛋白可以通过调节细胞凋亡来参与调节这些器官的功能。

此外，caspase在免疫反应中也发挥着重要作用。

当宿主细胞被病原体感染时，caspase可以通过识别特定的特异性蛋白，来启动宿主细胞的凋亡，从而清除身体内的寄生虫或抗原，从而起到抗病毒的作用。

总之，caspase是一类重要的半胱氨酸酶，它们在宿主身体内发挥着重要而多样化的功能。

它们不仅可以参与调节细胞维持正常繁殖的过程，提高细胞的存活能力，而且还可以在宿主的免疫反应中发挥作用，在一定程度上保护宿主细胞免受外界的损伤。

因此，研究caspase的生物学功能是生物界当今研究的热点，也是至关重要的科研工作。