神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化

PI3K-AKT-eNOS介导淫羊藿苷促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化研究PI3K/AKT-eNOS介导淫羊藿苷促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化研究引言：骨髓基质细胞是骨髓中的一类间质细胞，可产生成骨细胞，参与骨骼发育和修复的过程。

淫羊藿苷是一种天然草药，在中药学中被用作治疗骨骼疾病的药物。

已有的研究表明，淫羊藿苷可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞的成骨性分化，但其作用机制尚不清楚。

方法：本研究从细胞水平探究了PI3K/AKT-eNOS信号通路在淫羊藿苷促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化中的作用。

采用原代培养的骨髓基质细胞作为研究对象，在不同浓度的淫羊藿苷处理下，通过旋转刮伤实验和碱性磷酸酶染色等技术，评估其对细胞增殖和成骨性分化的影响。

同时，通过Western blot检测PI3K/AKT-eNOS信号通路的活性和相关蛋白的表达水平。

结果：我们的研究发现，在淫羊藿苷处理下，骨髓基质细胞的增殖能力受到抑制，而成骨性分化能力显著增强。

碱性磷酸酶染色结果显示，淫羊藿苷处理组的骨髓基质细胞产生更多的成骨细胞。

进一步的实验结果表明，淫羊藿苷处理可激活PI3K/AKT-eNOS信号通路，并提高eNOS蛋白和NO的表达水平。

讨论：淫羊藿苷通过激活PI3K/AKT-eNOS信号通路促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化。

PI3K/AKT-eNOS信号通路参与了多种细胞活动的调控，包括细胞增殖、分化和凋亡等。

在本研究中，我们观察到淫羊藿苷处理下骨髓基质细胞的凋亡率没有明显变化，说明其通过PI3K/AKT-eNOS信号通路促进成骨性分化，并不影响细胞的存活。

进一步分析发现，淫羊藿苷处理下eNOS蛋白和NO的表达水平升高，NO被认为是一种强力的神经递质，可调控骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化。

结论：本研究发现，淫羊藿苷可以通过激活PI3K/AKT-eNOS信号通路促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化。

骨细胞分泌sclerostin抑制骨形成罗明志;马云彤;罗雯;李莺【摘要】骨细胞可以感受理化刺激然后分泌多种信号分子调节骨重建.Sclerostin 是成熟性骨细胞分泌的一种抑制骨形成的糖蛋白.对sclerostin的发现、分泌细胞类型、分子特点和作用受体进行了简单回顾,并介绍sclerostin抑制成骨作用的信号通路,重点介绍sclerostin通过Wnt信号抑制成骨作用的分子机制.随后对基于sclerostin的作用机制设计药物用于治疗骨丢失的前景进行了展望.%Under physico-chemical stimulations,osteocytes secret multiple signal molecules to regulate bone remodeling.Sclerostin is a kind of glycoside protein secreted by mature osteocytes and inhibits bone formation.In this paper,we review the discovery,category of secretory cell,molecular features and action receptor of sclerostin and give an introduction to the signal pathway of sclerostin in inhibiting bone remodeling.We mainly address the molecular mechanism of sclerostin in inhibiting bone formation through Wnt signal.Based on the functional mechanism of sclerostin,we predict the possible treatment of bone loss.【期刊名称】《西安文理学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(015)002【总页数】4页(P6-9)【关键词】骨重建;骨细胞;sclerostin;Wnt信号【作者】罗明志;马云彤;罗雯;李莺【作者单位】西安文理学院生物技术学院,陕西西安710065／西北工业学生命学院,陕西西安710072;西安文理学院学报编辑部,陕西西安710065;西安文理学院生物技术学院,陕西西安710065;西安文理学院生物技术学院,陕西西安710065【正文语种】中文【中图分类】Q26骨是具有代谢活性的组织，受到多种理化因素调节.骨组织受到的机械应力发生改变时，骨量和组织结构将发生改变.增加骨组织的负载会导致骨量增加;骨组织负荷减小会导致骨量减少，如长时间卧床和失重会导致骨丢失［1］.两种类型细胞参与到骨重建，包括血液系统来源的破骨细胞和具有成骨作用的骨基质细胞来源的成骨细胞和骨细胞.成骨细胞和破骨细胞在骨组织内只是短时间的存在，且数量少，位置不定.骨细胞则是骨组织内的主要细胞，且长期存在［2］;而且骨细胞借助在骨陷窝-骨小管内的细胞突触和骨表面的细胞联系起来［3］，这种结构对于骨细胞感知机械应力和传递信号十分重要［4］.有研究表明骨细胞可能在骨组织响应机械应力的过程中起着重要作用［5］.但骨细胞感受机械应力后如何进一步地调控骨形成/骨吸收的平衡还不是很清楚.Martin认为骨细胞在感受机械应力的作用后会产生信号分子，通过骨陷窝-骨小管系统到达骨表面，抑制骨衬细胞的激活，并且抑制成骨细胞的骨形成［6］.早期的研究发现骨细胞可以分泌NO和PGE2等信号分子调节成骨作用.最新的研究发现骨细胞分泌的糖蛋白sclerostin在调节骨重建的过程中发挥关键作用，可以抑制骨形成［7］.1 Sclerostin的发现硬化性骨化病(Sclerosteosis)和Van Buchem综合症(van Buchem disease，vbch)是两类少见的骨骼紊乱性疾病，两种均为隐性遗传病，其主要特征都是骨量增加，对其致病机制的深入研究发现sclerostin.1.1 硬化性骨化病和Van Buchem综合症硬化性骨化病最早报道于1958年［8］.这种疾病最明显的特征是颅骨和下颌骨骨量增加，常见的症状还有口眼歪斜、巨人症和手部畸形.Van Buchem综合症和硬化性骨化病类似，表现为骨密度增加，但一般没有高身材和手部畸形病症.这两种疾病都是由骨形成活性增强导致骨量增加引起.Beighton在1984年推测这两种疾病的产生机制有相关性［9］.1.2 Sclerostin的发现比利时安特卫普大学医学遗传学系Van等人在1998［10］和1999年［11］首先采用细胞遗传学方法将硬化性骨化病及Van Buchem综合症的相关基因定位到了人11号染色体的17q12-q21区域;随后采用基因定位克隆方法将致病的SOST 基因克隆［8］.这种基因对应的蛋白称之为sclerostin.结果发现硬化性骨化病是由于这个基因的3种突变(2个在外显子上发生无义突变，1个在内含子剪切位点突变导致剪切错误)，Van Buchem综合症则是由于在SOST基因下游35 kb处一个含有SOST基因增强子的52 kb片段的缺失［12］，这些突变均导致骨细胞sclerostin表达量降低，引起骨量增加，上述现象提示这种基因对骨形成过程具有负调控作用.同时其他研究者的研究结果提示不同种族的患者SOST基因突变的位点可能有多种［13］.2 Sclerostin分泌细胞骨组织内sclerostin不能由未分化的成骨细胞表达，而是由成熟的矿化骨细胞表达［14］.Kenneth采用免疫组化的方法研究发现当成骨细胞分泌骨基质形成类骨质将自己包围后，自己就变成新生的骨细胞，但此时没有sclerostin表达，只有当基质矿化以后，这种蛋白才开始分泌，进而反馈性地抑制矿化作用.这种结果还提示该蛋白的产生应当是由一种刺激信号作用的结果.破骨细胞和成骨细胞均不能分泌sclerostin［15］.3 Sclerostin抑制成骨作用的分子机制3.1 Sclerostin作用受体Sclerostin是一种分泌性的糖蛋白，其氨基酸序列和分泌性的糖蛋白DAN家族相似.DAN家族包括DAN、cerberus、gremlin、DAN相关蛋白、cerberus和caronte，它们都有一个共同的特性，即含有可以抑制骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)活性的胱氨酸结结构［13］.BMP通过和具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的BMPⅠ和Ⅱ型受体结合，激活具有转录效应的蛋白Smad发挥功能，促进骨形成.该过程受到多个阶段调控，其中包括细胞外阶段.BMP结合的拮抗物可以阻止其和BMPR结合发挥功能.早期认为sclerostin是通过抑制骨形态发生蛋白信号发挥功能［16］，即认为sclerostin是一种骨形态发生蛋白的拮抗物，抑制BMP信号进而抑制骨形成.但Van研究发现sclerostin不会抑制KS483细胞碱性磷酸酶基础水平的表达，也不会抑制BMP诱导的C2C12细胞碱性磷酸酶激活;同时对BMP诱导的KS483细胞的Smad的磷酸化和MSX-2的转录激活均没有影响，这些现象与noggin和gremli等典型的BMP拮抗物的作用结果不同，不能阻止BMP引起的靶分子的激活，提示sclerostin在发挥作用的过程中可能不是通过BMP信号通路［17］.通过亲和实验发现sclerostin和BMP亲和力很低.随后的研究表明Wnt受体LRP5/6是sclerostin的受体［18］.3.2 Wnt信号通路Wnt信号在胚胎发育、肿瘤发生和可再生组织稳态维持中均具有重要作用［19］.信号起始于Wnt和细胞膜上复合受体的结合，这种受体包括卷曲蛋白(Frizzled，Fz)和LRP5/6蛋白.Wnt是一种分泌性糖蛋白家族，是发育过程中重要信号分子，多达几十种.Fz蛋白是一种G蛋白偶联受体蛋白.当Wnt和受体结合后会募集胞内一些蛋白和复合受体的胞内结构域结合，进而传递信号，如募集和修饰Disheveled蛋白.β-catenin是Wnt信号通路中的一个重要分子，它在胞质内的含量受到胞外Wnt 调节.当缺乏Wnt时，β-catenin会在casein kinase 1［20］和GSK-3β等多种蛋白的作用下磷酸化，随后和泛素结合，进而被蛋白酶降解.当Wnt存在时，可以抑制GSK-3β磷酸激酶的活性，使得β-catenin能够在胞质内积累，当浓度达到一定程度时，会转移到细胞核，和Tcf/Lef转录因子家族的蛋白结合，调控经典Wnt信号通路相关蛋白的表达［21］.依据Wnt和复合受体的不同，Wnt信号可以有3种不同的通路，分别为经典、非经典和Ca2+通路，其中经典Wnt通路在骨形成过程中具有重要作用.Wnt信号在多个层次均受到调控.细胞外的调控主要在两个方面，一类是分泌性的Fz相关蛋白，它们是Fz蛋白的诱饵蛋白，可以和Wnt结合，进而阻止Wnt和复合受体的结合.另外一类是和LRP5/6结合，抑制Wnt信号，包括dickkopf(Dkk)和sclerostin.对Dkk的研究发现它是一种Wnt信号的拮抗物，至今在哺乳动物中已发现4种Dkk.但是只有Dkk1和Dkk2是经典的Wnt信号的拮抗物，它们均可以和LRP5/6及Kremen的复合体结合，并且通过第二个富含半胱氨酸的结构域抑制Wnt信号［21］.3.3 Sclerostin通过Wnt信号抑制成骨作用硬化性骨化病是由于sclerostin表达缺失引起，这个结论提示sclerostin可能是成骨作用的抑制剂.与此相印证的是，在小鼠体内过表达sclerostin，然后以骨钙素作为成骨指标，结果发现骨量减少，同时骨矿含量、皮质厚度、骨小梁和骨长度均减小［16］.但是对骨吸收影响不大.体外的实验结果进一步表明sclerostin可以抑制成骨细胞的发育，包括成骨细胞的增殖以及早期和晚期分化［13］.同时还发现sclerostin可以增加成骨细胞的Caspase活性，诱导成骨细胞凋亡，这可能是sclerostin抑制骨形成的另外一种机制［22］.还有实验结果表明，被新矿化的基质包埋的骨细胞可以分泌sclerostin并运送到骨表面的成骨细胞，进而在各个阶段抑制成骨细胞的发育，最终导致骨形成的抑制;Li等人［23］研究表明sclerostin可以和LRP5/6结合，抑制成骨细胞经典Wnt信号通路，从而抑制骨形成.4 总结和展望综上所述，sclerostin是成熟性骨细胞分泌的一种抑制成骨作用的糖蛋白，可以和成骨细胞表面的LRP5/6结合，从而抑制Wnt信号，抑制成骨细胞的成骨活性.骨丢失是一种严重影响人类健康的骨疾病.现在已经找到一些药物可以对抗骨丢失，但除PTH还没有很好促进骨形成药物.因此深入研究sclerostin抑制骨形成的机制无论是对骨胳发育的认识还是对寻找治疗骨质疏松症的有效药物都具有重要的意义，如可以采用sclerostin抗体治疗骨丢失［24］.［参考文献］［1］ HUANG Y，DAI ZQ，LING SK，et al.Gravity，a regulation factor in the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Sci，2009，16(1):87.［2］ KNOTHE TATE ML，ADAMSON JR，TAMI AE，et al.The osteocyte ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(1):1-8.［3］ BELLIDO T.Osteocyte control of bone formation via Sost/sclerostin ［J］.J Musculoskelet Neuronal Interact，2006，6(4): 360-363.［4］ ARDEN EM，BURGER EH，NIJWEIDE PJ.Function of osteocytes in bone［J］.J Cell Biochem，1994，55:287-299.［5］ BURGER EH，KLEIN-NULEND J.Mechanotransduction in bone-role of the lacunocanalicular network［J］.FASEB J，1999，13:101-112.［6］ MARTIN RB.Does osteocyte formation cause the nonlinear refilling of osteons［J］.Bone，2000，26:71-78.［7］ CEJKA D，JÄGER-LANSKY A，KIEWEG H，et al.Sclerostin serum levels correlate positively with bone mineral density and microarchitecture in haemodialysis patients［J］.Nephrol Dial Transplant，2012，27(1):226-230.［8］ BALEMANS W，EBELING M，PATEL N，et al.Increased bone density in sclerosteosis is due to the deficiency of a novel secreted protein(SOST)［J］.Hum Mol Genet，2001，10:537-543.［9］ BEIGHTON P，BARNARD A，HAMERSMA H，et al.The syndromic status of sclerosteosis and van Buchem disease［J］.Clin.Genet，1984，25:175-181.［10］VAN HUL W，BALEMANS W，VAN HE，et al.Van Buchem disease(hyperostosis corticalis generalisata)maps to chromosome 17q12-q21［J］.Am J Hum Genet，1998，62:391-399.［11］BALEMANS W，VAN DEN EJ，FREIRE PAES-ALVES A，etal.Localization of the gene for sclerosteosis to the Van Buchem disease-gene region on chromosome 17q12-q21［J］.Am J Hum Genet，1999，64:1661-1669.［12］LÖWIK CW，VAN BEZOOIJEN RL.Wnt signaling is involved in the inhibitory action of sclerostin on BMP-stimulated bone formation［J］.J Musculoskelet Neuronal Interact，2006，6(4):357.［13］BRUNKOW 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2021氧化应激影响成骨细胞功能的研究综述范文 骨质疏松症（ osteoporosis,OP）是一种以骨量下降、骨组织微结构破坏为特征，使骨脆性增加，易发生骨折的代谢性骨病[1].随着人口老龄化，其发病率呈逐年上升趋势。

氧化应激被认为是参与骨质疏松发生、发展的一个独立危险因素[2].氧化应激与绝经后骨质疏松、糖皮质激素性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松发生、发展密切相关[3-5].骨质的完整性依赖于成骨细胞的骨形成功能与破骨细胞的骨吸收功能的平衡[6],氧化应激可影响成骨细胞功能。

本文就氧化应激影响成骨细胞功能的研究进展作一综述。

体内研究 活性氧（ reactive oxygen species,ROS）聚集、增加可致氧化应激，其具有双重作用，可氧化、破坏蛋白质、脂质、DNA,导致细胞功能改变，也可激活胞内多重适应性信号通路[7-10].细胞内存在抗氧化系统，其中铜锌超氧化物歧化酶（ CuZn-SOD）发挥重要作用，它由 sod1 基因编码[11-12].有文献报道，随年龄增长，sod1 基因敲除小鼠表现为明显骨量下降、骨胶原交联异常，sod1 敲除鼠成骨细胞数量、类骨质表面积、矿化物表面积、骨形成率显着下降[13],提示 sod1 基因敲除可致成骨细胞增殖、存活和分化功能下降。

提取 sod1 基因敲除鼠原代成骨细胞进行体外培养，发现 sod1 敲除鼠成骨细胞胞内 ROS 含量显着增加、成骨细胞增殖下降、凋亡增加。

应用抗氧化剂维生素 C 可逆转sod1 基因敲除对小鼠骨代谢及成骨细胞功能的影响，提示 sod1 敲除鼠骨表型改变主要原因是氧化应激增加，而非 sod1 基因缺失所致。

体外研究 ROS与细胞凋亡H2O2作为 ROS 的主要成分，可诱导凋亡相关基因 AIF、Bax 和caspase-3,9 表达，诱导成骨细胞凋亡[14].氧化应激可诱导成骨细胞凋亡已被广泛认可[15-16],但 ROS 致成骨细胞凋亡的具体分子机制尚未明确。

神经肽P物质及骨形态发生蛋白信号通路在ST2细胞成骨分化过程中的作用惠婷;张广灿;冯丹丹;汲平【摘要】目的探讨神经肽P物质(SP)在ST2细胞(小鼠骨髓间充质干细胞)成骨分化过程中的作用及机制,以期为颞下颌关节骨关节炎的治疗提供依据.方法对第3代ST2细胞分别用0、10-10、10-8、10-6、10-5 mol·L-1 SP培养,24、48、72 h后采用CCK-8实验检测细胞增殖情况.以10-6 mol·L-1 SP培养第3代ST2细胞l、3、5、7d后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(Colla Ⅰ)和骨钙素(OCN)的表达,免疫荧光染色检测细胞ALP活性.分别用SP、Noggin(骨形态发生蛋白信号通路抑制剂)、SP+Noggin和2％胎牛血清培养ST2细胞,采用ELISA法检测上清液中ALP、Colla Ⅰ和OCN的表达.结果CCK-8结果显示,24、48、72 h时均以10-6 mol·L-1SP促进ST2细胞增殖活性最为明显(P＜0.01).ELISA结果显示,ALP表达在5d时较对照组差异最为明显(P＜0.01),Colla Ⅰ和OCN的表达在7d时较对照组差异最为明显(P＜0.05);免疫荧光结果显示,ALP活性在5d时最强;加入抑制剂Noggin后,ALP、Colla Ⅰ和OCN表达量均降低.结论 SP可促进ST2细胞增殖和成骨分化,骨形态发生蛋白信号通路可能参与了此过程.【期刊名称】《华西口腔医学杂志》【年(卷),期】2018(036)004【总页数】6页(P378-383)【关键词】神经肽P物质;骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白信号通路;成骨分化【作者】惠婷;张广灿;冯丹丹;汲平【作者单位】山东大学口腔医院修复科山东省口腔组织再生重点实验室,济南250012;山东大学口腔医院修复科山东省口腔组织再生重点实验室,济南250012;山东大学口腔医院修复科山东省口腔组织再生重点实验室,济南250012;山东大学口腔医院修复科山东省口腔组织再生重点实验室,济南250012【正文语种】中文【中图分类】Q257颞下颌关节紊乱病是较为多见的一种口腔疾病，颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular osteoarthrosis，TMJ-OA）是其最严重的一个类型，是在多重因素的共同作用下导致软骨和软骨下骨合成与分解失调的结果[1]。

人源重组骨形态发生蛋白人源重组骨形态发生蛋白（BMP）是一种重要的生物活性蛋白质，对骨骼生长、愈合和再生具有重要的作用。

BMP最早是从动物骨细胞的培养上分离出来的，后经过基因重组技术，可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞等生物系统中大规模表达。

BMP作为一种多功能性生长因子，对于促进成骨细胞的增殖和分化，以及在骨骼生长、愈合过程中的相关信号传导起着关键作用。

BMP不仅在骨骼组织中具有重要的生物学功能，而且还能够促进软骨、齿、肌肉以及神经组织的形态生成和修复，因此在医学领域有着广泛的应用前景。

BMP通过与细胞表面的受体结合，激活细胞内信号通路，促进转录因子的激活，进而调控相关基因的表达，从而影响细胞增殖、分化和骨基质的沉积。

在临床上，BMP已经被广泛应用于骨科领域，用于骨折愈合、骨缺损修复，以及脊柱融合手术等方面。

通过外源性的BMP，可以促进骨细胞的增殖和分化，加速骨折的愈合，减少骨折的愈合时间，同时也可以用于治疗骨缺损和进行脊柱融合手术。

这些临床应用有效地提高了骨骼组织的再生和修复能力，使得一些原本难以治愈的骨科疾病得到了有效的治疗，对于患者的康复具有重要的意义。

此外，BMP还被广泛应用于组织工程和再生医学领域。

在组织工程中，通过载体材料载体等途径将BMP导入到受损组织中，可以促进受损组织的修复和再生，为组织工程的应用提供了有力的支持。

在再生医学领域，BMP可以用于促进肌骨组织的再生和修复，为一些临床难题提供新的治疗思路。

同时，BMP也为器官移植、皮肤再生、血管再生等领域提供了新的可能性和方法。

不过，尽管BMP在临床和研究中有着广泛的应用前景，但是其在临床应用中也存在一些问题。

一方面，目前尚缺乏对BMP临床应用的有效标准和规范，导致一些不规范的使用，容易出现不当使用和副作用等问题。

另一方面，在大规模生产BMP的过程中，也存在成本高、纯度低、活性不稳定等问题，限制了其在临床中的应用。

因此，未来需要加强对BMP的研究和开发，提高其纯度和活性，建立有效的临床应用标准和规范，以便更好地发挥其在医学领域的作用。

《药物化学Ⅰ》在线作业二-0001试卷总分:100 得分:100一、单选题 (共 20 道试题,共 100 分)1.以下关于神经递质的描述不正确的是？A.神经释放神经递质B.神经递质需要从神经向目标细胞传递信息C.神经递质需要与目标细胞有显著的距离D.神经递质与目标细胞的受体结合正确答案:D2.以下哪种过程是描述DNA复制而制造出2个子DNA？A.再生B.复制C.翻译D.转录正确答案:B3.以下关于酶催化反应的论述不正确的是？A.大部分受体是镶嵌于细胞膜上的蛋白B.受体一般在表面含有凹穴或者空隙称之为结合部位C.受体与化学信使结合，比如与神经递质或激素D.受体催化化学信使的反应正确答案:D4.一些蛋白需要非蛋白类的底物催化反应。

以下的定义哪个更能准确表达这类底物？A.假基团B.辅因子C.辅酶D.调控器正确答案:C5.对映体中有较高药理活性或与受体有较强结合力的一个对映体称作优映体，较弱药理活性或亲和力的对映体称作劣映体。

A.对B.错正确答案:A6.机体对营养物质或其他必需的外源性物质的摄取大都是立体特异性的，例如人体只能吸收D-氨基酸和L-葡萄糖，而难以吸收其对映体；对非对称性的药物往往也表现选择性作用。

B.错正确答案:B7.有机分子的构象是指分子中原子或基团共价连接与刚性骨架（双键或环系）或不对称手性部位，造成在空间排列不同的异构现象。

A.对B.错正确答案:B8.共键多用于化学治疗药，使病原体的受体靶标与药物成化学键，发生持久性的抑制，清除病原体。

A.对B.错正确答案:A9.非竞争性抑制剂同酶的结合位点与底物不同，所以能够同时和底物与酶结合。

A.对B.错正确答案:A10.以下哪类分子参与蛋白的磷酸化酶a的反馈性控制?A.葡萄糖-1-磷酸B.肾上腺素C.糖原D.AMP正确答案:D11.以下关于配体门离子通道受体的描述不正确的是？A.配体门可以离子通道受体在细胞膜上B.神经递质可以充当配体门离子通道的化学信使C.配体门可以离子通道受体包含5个糖蛋白D.膜潜能的区别会影响离子通道的开启和关闭正确答案:D12.肽模拟物反向操作还常常变换氨基酸的构型，由L-型变成D-构型，生成的肽模拟物称为反向-翻转异构体（retro-inverso isomer）。

细胞骨架与细胞分化的关系细胞骨架是细胞内部的重要组成部分，它决定了细胞形态和功能，同时也参与了细胞的运动、材料转运等过程。

细胞分化是细胞生命中的一个重要过程，它引导着干细胞向特定功能细胞的转化。

那么，细胞骨架与细胞分化有着怎样的关系呢？从骨架结构、信号通路和细胞分化过程三个方面来探讨。

一、骨架结构对细胞分化的影响细胞骨架由微丝、微管和中间丝组成，其中微丝和微管在细胞形态和动态中起着至关重要的作用。

以神经细胞为例，微管在神经细胞轴突的生长过程中发挥着重要作用，细微的微管变化都会对神经细胞轴突发育产生影响。

在神经元分化中，微管和中间丝参与了神经元轴突的伸长、神经元分化等重要过程。

在神经元分化过程中，还出现了独特的神经元特化微管，这些微管在神经元的特化过程中起到了重要作用。

因此，细胞骨架的组成及结构对细胞分化有着很大的影响。

二、信号通路的调控与细胞分化细胞骨架的装配和剪除过程中，细胞骨架相关蛋白在信号调控过程中发挥着重要作用。

具体来说，细胞骨架蛋白可以与神经元特异性转录调节因子相互作用，调节神经元分化、轴突生长等过程。

以微管为例，微管复合物可以与蛋白质相互作用，调节其生长和动态。

一些特定的微管/微丝稳定蛋白和变形蛋白也参与了细胞骨架的装配和分解。

这些蛋白质能通过生化信号通路的调节，参与到细胞分化过程中，是细胞分化的关键因素之一。

三、细胞分化过程中的角色在细胞分化的过程中，微管和微丝蛋白都扮演了重要的角色。

例如，在干细胞分化为心肌细胞时，微管和微丝的形成和动态变化都是需要的。

此外，细胞分化过程中的微管变化还能够通过运输小泡来在细胞内部传递信号，并促进相关蛋白的调控，将干细胞转化为特定的细胞类型。

总的来说，细胞骨架作为细胞结构和功能的重要组成部分，与细胞分化过程息息相关。

其骨架结构、信号通路的调控以及在细胞分化过程中的角色，都是影响细胞分化的重要因素。

深入理解它们之间的关系，对于研究细胞分化机制具有重要意义。

The Regulatory Landscape of OsteogenicDifferentiationAbstract间质干细胞(MSCS向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的局部,当它被不恰当地调控时,可能产生疾病,比方骨癌或骨质疏松.利用无偏倚的高通量方法,我们描述了在人类MSCs向骨谱系分化的过程中,基因表达,组蛋白修饰,以及DNA甲基化方面整体改变的图景.止匕外,我们第一次提供了一份基因组范围上的,关于骨主要调控转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2在人类成骨细胞中DNA结合位点的描述,显示出目标基因与增殖, 迁移及凋亡调控有关,并与p53调控的基因有明显的重叠.这些发现扩展了正在出现的证据,这些证据是关于RUNX2在癌症,包括骨代谢,以及p53调控网络中有作用的.我们进一步揭示了RUNX2结合在远端的调控元件,启动子上,还有很高的频率结合在基因的3'末尾上.最后,我们识别出了TEAD2和GTF2I是一种新的成骨调控因子.Introduction间质干细胞或者基质细胞(MSCS有多谱系潜能,可以向成骨,成脂,成软骨,还有其它谱系分化(1).MSCs出现在骨髓和其它间质组织中,可能迁移到损伤或炎症处, 参与组织修复(2).MSCs可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化,这为从分子上研究成骨提供了方便的工具(1).关于这一过程的更多知识,对根底研究及MSC时骨骼再生医学上的临床应用都是十分重要的(3),同样地,理解它在骨病中失调的情况也很重要,比方说癌症.在这点上,非常有意思的是骨肉瘤,最常见的骨原发恶性肿瘤,可能是由基因及表观遗传上的改变打断了MSCs向成骨的分化所致〔4〕.干细胞分化受基因表达的变化所高度调控,这种变化在转录水平上与DNA或染色质结合在转录调控子上有关,或是与染色质图像的局部改变有关〔5〜7〕.高通量方法的开展,比方RNA测序〔RNA-SeQ ,以及染色质免疫沉淀及测序〔CHIP-Seq ,使人们可以对这种改变.在基因组水平上进行描述〔8, 9〕举例来说,RNA-Seq可以系统性地发现启动子与外显子的轮流使用〔10〕,而CHIP-SeqS示特定的组蛋白修饰区域,以及这些变化是如何改变基因活性的〔5, 8〕.CHIP-Se也使人们可以发现基因组结合位点,并为广泛的转录因子〔TF9寻找目标基因〔11, 12〕.止匕外,综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区域,比方启动子和增强子,这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点〔TFBS分布,以帮助发现新的生物过程调控因子〔5〕.在单倍体RUNX2缺乏患者中的骨骼发育缺陷〔13〕,或是Runx2缺合子〔nullizygous〕小鼠中骨化骨的缺失〔14, 15〕,揭示了RUNT 相关转录因子2 〔RUNX2即CBFA1对于骨的发育是不可或缺的.在成骨中,RUNX2涉及调控增殖,迁移,定型,以及向成骨谱系的分化〔16〜19〕.RUNX2对上游信号起反响,调控基因的表达,这些上游信号包括TGFB BMP及Wnt信号通路〔20〜23〕;但是,成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那么好.除了它在发育和失调中的作用,RUNX2还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2与MYC原癌基因协同,在造血谱系中启动瘤变发生〔24〕,近期的证据提示在乳腺癌和前列腺癌细胞中, RUNX2的肿瘤生长和代谢属性〔25〜27〕.在骨肉瘤中,RUNX2常常是过度表达的,这与预后不良有联系(28).有趣的是,关于RUNXW口p53相互作用的证据开始浮现,包括因DNA损伤所致的RUNX2卬制p53介导的基因表达(29),以及p53依赖性RUNX2蛋白水平调控的证据(30).我们描述了从非肿瘤生成性,不死化的MSC细胞系向成骨分化过程中的转录组及表观基因组上的特征.此外,我们第一次报导了骨主要调控因子RUNX2在人类成骨细胞中的基因组范围的结合位点,并揭示了2000多个目标基因,这些目标基由于研究骨生物学中RUNX2的转录调控作用提供了新的亮光.我们也利用组蛋白CHIP-SecT生的表观基因组特点来识别与分化诱导性染色质改变有关的启动子,并预测TEAD开口GTF2I是这些启动子的新调控因子.最后,通过沉默TEAD港口GTF2I的表达,我们确认了这些转录因子在调控成骨分化方面的作用.Materials and Methods暂略RESULTSiMSC#3细胞向成骨谱系分化引起基因表达的整体改变为了研究从MSCs开始的成骨分化,我们使用了我们实验室产生的非肿瘤形成性细胞系(iMSC#3 ,方法是通过端粒酶的异位表达(Skarn et al.,manuscript submitted for publication )从而不死化.这个细胞系可以受转录操控,并且在多次传代后仍然有多谱系分化潜能.甚至,在基因表达水平上,iMSC#3细胞非常像人原始MSCs提示细胞的不死化没有彻底改变它们的MSC特性(Supporting information Fig.SI).为了成骨,iMSC#3细胞被放在DM中培养28天,强力茜素红S染色提示矿化基质形成(Fig.1A) .为了进一步检验分化的程度,用RNA- Seq技术从未分化细胞(Day 0)和分化细胞(Day 28)中测定了基因整体表达情况,并做比照.我们所发现的在分化中上调或下调的转录物,其所对应的基因分别为1462个和1695个,幅度至少是2倍或更多(Fig.18 .复制实验显示出高水平相关性〔Supporting information Fig.S2〕.使用精巧路径分析〔IPA〕,我们发现上调基因与增殖,细胞死亡,骨骼发育,以及细胞运动相关,而下调基因与细胞周期调控有关〔Fig.1..的成骨标志物,包括ALPL 〔碱性磷酸酶〕, RUNX2, ATF4〔活化转录因子4〕 , OMD 〔骨调蛋白〕,以及FOXO1 〔叉头框01〕被发现是上调的,而MSC标志物,包括MCAM 〔黑色素细胞黏附分子〕, ENG 〔内皮糖蛋白〕,CLCF1 〔心肌营养蛋白样细胞因子1〕 , TPM1 〔原肌球蛋白1%〕,以及CD44 〔CD44分子［印度血型］〕被发现是下调的〔Fig.1D〕.分化iMSC#3细胞的表观遗传分布为了研究成骨过程中基因组范围的表观遗传改变,我们在0天和28天时,利用CHIP-Seq苗述了代表着染色质不同功能状态的组蛋白H3修饰的分布情况.我们检验了H3K4m3的分布,它在启动子中很丰富〔8, 36〕 , H3K9ac和H3K27ac的分布,它们在活化调控元件中很丰富〔37, 38〕 , H3K36m3的分布,发现于活化的已转录基因中〔36〕,以及抑制性修饰H3K27m3的分布,典型情况下它分布广泛,覆盖启动子,编码区,以及基因间区〔8, 39〕.关于0天和28天时ALPL位点的CHIP-Se或RNA-Seq富集分布图已给出〔Fig.2A〕.该图显示转录水平下调,这与H3K4m3和H3K36m3分别在启动子和编码区的富集程度上升相一致.多个H3K27ac及H3K9ac峰提示转录元件活化,而在基因的上游发现H3K27m3甲基化受抑制〔Fig.2Q .分化伴有染色质图景的变化为了从整体上分析组蛋白修饰的改变,我们计算了整个基因组中读取区域相对于500bp 区域的倍数变化〔Day 28/Day 0〕〔the fold changes of reads aligning to 500bp regions throughout the genome was calcuate.. 总的来说, 我们发现分化诱导的H3K4m3, H3K9ac H3K27aq以及H3K36me3的富集显示出正相关性,而抑制性甲基化的改变很大程度上与活化标志物的改变呈负相关〔Fig.2B.我们进一步发现分化的诱导伴随着全基因组范围上的H3K9及H3K27的乙酰化缺失,而H3K4m3和H3K27m3的总体水平仍然相对恒定〔Fig.2c所有区域〕.把这种分析限定在基因启动子周围,我们发现乙酰化总体上缺失,但不是基因组范围上的,而H3K27m3富集程度在启动子处是总体上升高的(Fig.2C; ±2kbo力5.'H3K4m3在启动子处的富集率保持不变(Fig.2C; ±2kbof 5).启动子区域数量很大,显示组蛋白富集程度在相应基因转录水平未发生变化的情况下增加或减少了( Fig.2酚.特别是,数千个启动子处乙酰化的减少, 伴有H3K9和H3K27之间极大范围的重叠(数据未给出),影响那些涉及基因调控,细胞生存,生长,以及增殖的基因(Fig.2D,2B.有趣的是,在其启动子处H3K27m3水平增高或降低的基因,与肿瘤发生有很强的关联.H3K27m3富集程度的增加与神经系统发育有很强的关系(Fig.2B.对H3K4m3,其富集程度增加与发育过程相关,而降低与细胞周期有关(Fig.2E.一般来说,表达上调与H3K4m3, H3K9ac以及H3K27ac富集程度增加呈正相关(Supporting information Fig.S3).对H3K27m3的变化与基因总体水平上的表达情况之间没有发现什么相关性(Supporting information Fig.S3),分别只有131个上调的基因和81个下调的基因在其启动子区域显示出明显的富集程度变化(数据未给出).IPA分析发现这些基因功能上没有明显的富集.除了组蛋白修饰,我们还研究了0天和28天时,4500个CpG位点上DNA 甲基化的总体变化,使用的是HumanMethylation450BeadChIP试验.这种试验覆盖了99%的Refseq 基因,每个基因平均覆盖17个CpG位点.我们发现只有1273个CpG位点的甲基化状态发生了改变,其中1121个位点甲基化程度降低,152个位点甲基化程度增高.甲基化状态变化与710个基因相关,平均每个基因1.7个CpG位点,只有27个受影响的基因超过了2个CpG位点(Supporting Information Fig.S4; Supporting Information Table S4.因此,DNA 甲基化保持着相对恒定,在限制MSCs向肿瘤生成方向分化方面,没有表现出重要的调控作用.RUNX2基因的替代性转录变异RUNX2是成骨分化的主要调控者,我们更详细地研究这个基因的表达情况.在0天细胞中,通过RNA测序发现主要的转录源自P1启动子(Fig.3A).在诱导分化时,上游的P2启动子受诱导,正如从第28天的两个第一外显子(first exon) RNA测序数据增加所显示的那样(Fig.3A).另外,第28 天时P2启动子处的H3K4m3,以及在P2和P1启动子之间的编码区域中的H3K36m3富集程度的增力口,支持了P2转录起始位点的分化诱导性激活〔Fig.3Q.TaqMan qPCR使用覆盖两个不同外显子连接处的引物〔如Figure 3A, 3B所示〕,证实了P2启动子的转录显著增强,而P1启动子只有稍微的增加〔Fig.3.；但是,没有发现蛋白质水平上的增加〔Fig.3酚.有趣的是,位于RUNX2基因外显子2和外显子3之间的一个非RefSeq且去口被ENCODES释过的外显子,其表达情况受到了分化的诱导〔Fig.3A,3B星号〕.包含这一外显子的转录产物没有被任何下游的外显子读取,RNA-Seq队列数据〔Supporting miRBase注释序歹！J 〔Supporting Information Table S5〕.源自miRBase的序列代表着一种miRNA转录产物中预计的发夹局部,不包含原始转录产物的全长度信息.因此,对于这些基因我们无法确定RUNX2是结合在5瑞还是3瑞,正如对其它类型基因一样.但值得注意的是在注释的miRNA近端发现了很强的RUNX2富集,这些miRNA有骨生物学方面的作用,包括mir23a-27a-24-2藤集, mir-22, mir-21 , mir-143, mir-145, mir-221 ,以及mir-214[40~47] 〔Supporting Information Fig.S8〕.其它伴有RUNX2强烈富集的miRNA基因包括mir-4530, mir-3619, mir-let7a3 以及let7b, mir-612 以及mir199a1 〔Supporting Information Fig.S3.RUNX2与基因5端和3端结合的频率是差不多的,在基因内区域出现的频率高于基因间区域〔Fig.4F〕.所有RUNX2结合区域中差不多一半也有H3K27ac 的富集,并且这些区域中大约三分之一也被H3K4m3结合〔Fig.4G〕.这提示RUNX2结合同时激活了启动子和增强子.只有一小局部仅与H3K4m3重叠.我们发现基因的5端大局部有H3K27ac 〔接近75%〕及H3K4m3 〔50%〕的富集, 提示RUNX2启动子结合主要发生在转录活化基因处.在基因的3'端区域,与启动子处相比,较少与H3K27a怀口H3K4m3重叠〔Fig.4G〕. COL1A1基因处RUNX2和组蛋白ChIP-Se吩布情况是上述类型的一个例子〔Fig.4H〕.在RUNX2的所有目标基因中,901个基因只有5端结合,724个基因只有3端结合,而541个基因既有5'端结合也有3端结合〔Fig.4I; Supporting Information Table S10A-S10C.IPA分析显示,RUNX2结合在5端还是3端,结合位点不同,基因的细胞学功能也不同〔Fig.4D.5'端和3'端都有RUNX2结合的基因与细胞的运动和发育显著相关,就像ERK PDGF BB以及TGFB上游信号一样, 而5'端结合RUNX2的基因与细胞间信号传递有关,3'端结合RUNX2的基因与细胞死亡和生存有关(Fig.4I, 4J).更多关于RUNX2在目标基因处的ChIP-Se信集分布情况请见Supporting Information Fig.SQ调控肿瘤形成的新TFs的识别为了识别出涉及调控肿瘤形成分化的其它及潜在新转录因子(TF9 ,我们在启动子和增强子中做了TFBS&集分析,分析的是H3K4m3, H3K9ac及H3K27ac在第28天时相对于第0天时富集程度增加的情况,用的是Uniprobe,Jaspar;以及Transfac数据库.H3K4m3区域是唯一非常明确的有分化模体显著富集的区域的集合,所以我们把我们的分析集中到这种组蛋白标记物上.为了进一步缩小研究范围,我们找到了那些专门位于基因启动子上(离基因5'端±2kb的模体,分化后这些启动子上H3K4m3的富集程度增加,而那些模体也上调了基因的表达,这是将第28天与第0天的RNA测序结果进行比对得出的(To further narrow down the search,we looked for motifs exclusively inpromoters( 士2kb from 5 ' gene end)of genes with increased H3K4m3 enrichment in theirpromoter after differentiation, and which also had upregulated gene expression, as determined by RNA-Seq, at Day 28 relative to Da» 0.用于识另U新TFs的一个流程概括请见Supporting Information Figure S1tt iMSC#3细胞中表达程度无法发觉的TFs的模体被排除在外,剩下的最显著的模体是属于TEA域家族成员2(TEAD2 , PURA GTF2I重复域内容1 (GTF2IRD1 ,锌指蛋白148 (ZNF146 ,以及通用转录因子Hi的(GFT2I (Fig.5A).在这些模体中, TEAD2模体是最常出现的,而在含有每种模体的启动子中都存在广泛的重叠, 特别是TEAD2 GTF2IRD似及PURA(Fig.5B).为预测TEAD2目标基因而做的IPA分析显示它与细胞形态,发育(包括骨骼发育,数据未列出),生长,以及增殖,细胞运动及细胞死亡有关(Fig.5..为了研究每种TF在成骨过程中起的潜在调控作用,在iMSC#3细胞分化期间,用两段分开的小片段干扰RNAs(siRNAs重复敲除掉每种TF的表达.对每种TF的这种siRNA处理重复了7~10次,在每次敲除72小时后用定量PCRM定了敲除效率(Supporting Information Fig.S11).第28 天时,细胞培养基用茜素红染色,成像,染色也充当测定分化的手段.对GTF2I和TEAD2与同样使用siRNA处理的对照组细胞相比,染色显著减少(Fig.5D,5E ,强烈提示由于敲除,分化受到了特别的抑制.对GTF2IRD便口ZNF148在其中一份经siRNA 处理的细胞中观察到了染色显著减少的现象,但其它细胞中未发现( Supporting InformationFig.S12).对PURA的敲除,我们没有观察到在矿化方面有任何显著的影响(Supporting Information Fig.S12.DISCUSSION我们使用了不死化的非肿瘤生成性MSC细胞系,iMSC#3,以研究成骨分化期间基因调控变化.分化伴随着基因表达的变化,这些基因表达与分裂下降有关,同时那些设计成骨功能的基因表达上调,正如其他人观察到的那样(48,49),并且与分化跟细胞周期进展停滞有关〞的观念相吻合.另外,与细胞死亡和生存的基因上调了,这与之前观察到的成骨矿化中涉及的凋亡过程相一致(50).止匕外,涉及细胞运动的基因上调,提示离体成骨过程中细胞迁移起一定的作用.第28天细胞中,这些基因的一局部与RUNX%吉合(Supporting Information Fig.S6),支持了之前关于RUNX2是成骨分化过程中迁移调控因子的发现(19).基因表达的上调和下调分别与活化组蛋白修饰富集程度的增加和减少呈相关关系,正如其他人报导的那样(5, 8).不过,已经知道H3K27m3的动态变化发生在胚胎干细胞分化期间的启动子位置上(8, 39),仅影响少数分化性表达的基因,因此似乎对MSCs向成骨方向分化的调控意义不大.但是,在很多表达程度没有发生可发觉变化的基因的启动子上,发现了广泛的表观遗传重塑. 我们发现涉及神经形成的基因启动子处H3K27m3富集程度增力口,提示MSCs的神经分化潜能在其向成骨方向分化时受到了限制.值得注意的是,已发现Zeste2增强子的抑制,即H3K27m3的转甲基酶反响,能增强MSCs向神经方向的分化(51).反过来,在IPA分析中,启动子区域H3K27m3富集程度下降或H3K27ac富集程度增加的那些基因,跟肿瘤形成有强烈的关系,提示组蛋白修饰情况的改变与基因处发生的基因活化有关,这对它们在肿瘤开展过程中失调的观点提出了质疑.总体上来说,这些变化可以涉及到某种图式形成前机制中,这种机制在细胞执行下一阶段生长程序之前,限制着基因的活化或抑制.止匕外,我们发现分化诱导基因组范围上的组蛋白H3K9和H3K27乙酰化水平降低.以前曾经描述过,在MSCs向成骨方向分化期间,基因启动子处H3K9ac富集程度总体上降低(52).而且,在成肌,成脂,星形细胞以及少突细胞分化中也发现了组蛋白乙酰化水平降低(7, 53, 54).合起来,这些发现提示在细胞分化中,启动子处以及远端调控元件处的去乙酰化可以是一种普遍现象,或许与染色质局部范围凝聚有关,这种凝聚使基因自由度变小,而基因的自由度跟转录和分化潜能是有关的.乙酰化减少的机制可能是组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白脱乙酰基酶活性之间平衡的移动,或是潜在组蛋白分裂(potentially histone cleavage)(55).RUNX2表达的研究说明第28天时P1和P2启动子都有转录,提示这两种同工蛋白出现在分化细胞中.这两种同工体蛋白质之间只有N端19个氨基酸不同(56).从突变小鼠中得到的证据提示,这两者中任意一种的使用起的作用更像是在整个发育期促进RUNX2表达的空间调节,而不是产生两种不同功能的蛋白质(57);但是,也有人报导了这两种蛋白质之间功能上的不同(56).匪夷所思的是,分化过程伴有RUNX2转录物水平的强烈增高,而这在蛋白质水平上并没有反映出来,这些蛋白质与一种短转录产物的产生有相关关系,这种转录产物终止于P1启动子上游的一个新外显子处.这一短转录产物或许可以解释在其它研究中也观察到的(58) , RUNX2mRN均蛋白质水平之间的矛盾.在ENCOD即该转录产物被注释为编码蛋白质；但是尚不清楚其任何功能作用.尽管预测它是编码蛋白质的,在转录产物与蛋白质丰富程度有矛盾的观察根底上,有一点可以推敲的是这种转录产物有潜在的,独立于译的功能,很有可能涉及到一种RNA介导的调控机制,这种调控机制可以影响到来自RUNX2位点或其它基因的转录产物.值得注意的是,我们也发现了骨肉瘤中这种短转录产物的表达( Lorenz et al.,数据未发表).RUNX2是一种成骨过程中增殖和分化的调控因子(16, 17).我们揭示了数百种与这一过程相关的RUNX2®1目标基因(Supporting Information Table S7A);因此我们的数据强烈支持之前的发现,并帮助说明了涉及执行成骨方向分化过程中这些方面的基因调控网络.RUNX2目标基因也与细胞形成组织有关,包括调控肌动蛋白细胞骨架,微管,以及局部黏附,还有迁移与凋亡(Supporting Information Table S7A ,提示RUNX2涉及分化期间对这些过程的调控(19, 59),可能也可以阐述RUNX2在癌症中,以及在特定代谢过程中失调造成的肿瘤生成作用(27).之前两项研究已经报导了癌症环境下,RUNX2结合位点在基因组范围上的分布情况.首先,对前列腺癌细胞系中过度表达且受到标记的RUNX2,彳C ChIP-Se裱明其主要结合在内含子区域及基因间区域,结合在基因启动子处的频率低,但是,它结合的启动子对应的目标基因跟分泌功能有关(60).第二项研究识别出了SAOS-2t肉瘤细胞系中2339个RUNX2目标基因,用的是ChIP和启动子微阵列,发现它主要结合在那些跟细胞黏附和运动性有关的基因上(61).虽然用不同的实验流程和分析平台评估了RUNX2的结合位点,但比拟这些数据,我们只发现了243个共同基因(Supporting Information Table S11).总而言之,这可能指出了由于肿瘤背景环境所致的RUNX2吉合特异性的转移,这涉及到对其正常目标基因调控的缺失.新出现的证据说明p53和RUNX2^、可有调控性相互作用.在来自p53无效(null)小鼠的骨祖细胞中,RUNX2表达增力口(62),在U20S细胞中发现RUNX2蛋白水平受p53依赖性miRNA mir-34c 作用而下调(30).止匕外,人们发现RUNX2在BAX基因启动子处与p53相互作用,下调它的表达,并抑制由DNA损伤产生的细胞凋亡(29).我们识别出了154个基因,它们直接或间接下调p53的目标基因,包括那些涉及凋亡和细胞周期调控的基因( Supporting Information Table S8),因此提示RUNX2在p53调控网络中有广泛的作用.在我们的分析中,PDGF BB^另一个预测的RUNX2目标基因.PDGF BB^ 一种MSCs增殖与迁移的调控因子(63),有报导说它对成骨方向分化同时具有刺激和抑制作用(64,65).就我们所知,没有报导文献将PDGF言号途径与RUNX2的功能联系起来. 我们关于相当数量的RUNX2目标基因是的PDGF目标基因这一发现,提示RUNX2的调控可能与分化早期的增殖扩张有关.不过,已矿化的细胞中RUNX2结合到PDGF目标基因上这一点,提示它在分化晚期起作用.令人惊讶的是,我们发现RUNX珈繁地结合在基因3'末端,或是紧靠其末端的下游,在许多例子中,其富集的范围非常广( Supporting Information Fig.S9 . RUNX2在5端和3端都富集的那些基因,KM细胞运动,发育, TGFB1 以及PDGF BB言号途径强烈相关,只有5端结合的基因与细胞间信号途径有关,只有3'端结合的基因与细胞死亡有关.这可能提示不同的上游调控途径影响RUNX2与目标基因的结合方式.止匕外,RUNX2在活化组蛋白标志物缺失的情况下更多地结合在3'端而不是5'端,提示3'端的结合发生在不同的背景环境下.以前的文献描述过其它TFs结合在基因3'末端或其附近,已经提示它在调控非编码RNAs反义转录成相应的蛋白编码基因方面起作用(66).我们有初步的链特异性全RNA-Se嗷据,提示在第28天iMSC#3 细胞中,反义转录并没有广泛地跟RNA3端结合相关(数据未列出).令人费解的是,有些具有强烈3'端结合的基因,在其组蛋白富集区域非常近的地方有miRNA基因,因此RUNX2的结合与其说涉及到调控蛋白编码基因, 不如说更像是涉及调控那些miRNA.但是这只是说少数基因是这样的.RUNX2 在3'端结合的其它作用可能是调控转录终端,或是参与循环到启动子(involvement in looping to promoter),正如描述过的RNAPH在高表达基因中的作用那样(67).尚需做更多的实验来确定RUNX2在基因3'端结合的生物学作用.我们发现RUNX2蛋白水平相对较少受到分化的影响.因此,RUNX2的成骨作用更像是应该被解释为,它在诱导分化之前和之后结合在不同的基因组位点上.但是,通过研究RUNX2吉合位点上潜在的分化诱导性组蛋白修饰变化,我们发现不存在这种相关性.因此,在我们的模型中,那些RUNX2结合发生的主要位点,第0天和第28天之间的组蛋白修饰情况没有发生变化.因此, RUNX2 向染色质的定位,似乎不是由本研究中这几种组蛋白修饰的动态变化所驱动的.基于有分化诱导组蛋白修饰变化的那些区域,我们预言5种其它的调控分化的TF§通过基因敲除揭示出GTF2I和TEAD浏矿化有负性作用.编码GTF2I 的基因位于7号染色体上某区域,该区域在Williams-Beuren综合征(WB0中被删除掉,因此该基因被认为参与了该综合征(68).WBS影响发育的几个方面,包括颅骨特征及身高,提示骨的发育受到了影响(68).有报道称在小鼠C2c12成肌细胞中的成骨分化早期,敲除GTF2I 增加了ALPL 和BGLAPS因的表达(69).与之相反,我们的发现提示敲除GTF2I对成骨分化有负性作用；不过,我们没有研究分化早期阶段基因的表达情况.止匕外,用的细胞类型不同,流程不同,可以解释这种不一致.TEAD2是Hippo信号途径中的一个影响因子,该信号途径通过平衡增殖与分化,在调控组织大小方面起关键作用(70).TAZ； Hippo信号途径的一个介导因子,通过与RUNX2的相互作用来活化成骨基因,是间质分化中一个关键性的调节因子(71).另外,TAZ在神经胶质瘤细胞中的过度表达,以一种TEADK赖性方式,诱导了成骨方向分化(72).就我们所致,还没有研究特别探索过正常骨分化中的TEAD2我们的结果提示TEAD2的表达,对成骨分化的晚期阶段要实现矿化而言,是必要的.CONCLUSION总而言之,我们提供了成骨分化调控图景的新观点.我们描述了基因组范围上的染色质重塑,这种重塑相对于可以发现的基因表达程度变化而言,独立影响了发育基因和癌症相关基因.除此之外,我们提供了新的证据,以解释RUNX2是如何调控那些跟细胞增殖,分化及癌变相关的过程的,我们的方法是揭示出其在成骨细胞中的基因组结合位点,以及目标基因.最后,基于对那些组蛋白修饰状态改变区域中TFBS勺预测,我们识别了两种转录因子TEAD2和GTF2I并提供了其在成骨方向分化中调控作用的证据.。