纤维素酶的分离纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定

蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。

目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。

一、质分离纯化的一般原则

1. 原料的选择

原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。

蛋白分布：体液、组织、细胞定位

2. 破碎方法：

(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。

如：捣碎法、研磨、匀桨法

(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

如：反复冻融、渗透压、超声破碎

(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.

如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）

(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等

3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法

4. 先粗后细，分级分离

粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。

精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。

5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）

纤维素酶产生菌的筛选分离

一、实验基本流程

①：培养基的配制，灭菌（需灭菌的器材）

②：a、菌种分离；b、有关试剂的准备（刚果红的配制、DNS试剂的配制、0.1%葡萄糖标样的配制）

③：c、鉴定菌种及纯化；d、葡萄糖标准曲线的制备；

④：e、发酵；f、酶活测定；

二、实验原理

1、纤维素酶产生菌的鉴定

a、刚果红可以跟大分子多糖牢固结合。

b、纤维素是大分子多糖，跟刚果红牢固结合。

c、纤维素酶降解平板中的纤维素成小分子糖，那么刚果红无法与小分子糖结合，就被洗脱下来，呈现透明圈。

d、在通常的纤维素刚果红培养基筛选菌种的程序中，先用含有纤维素的平板培养菌，等菌长出来后，把菌体刮离，然后加入刚果红染色10-15分钟，再用NaCl冲洗2-3次，产生透明圈的就是能水解纤维素的菌。也可以把刚果红直接加到平板中，菌在生长过程中也会逐渐形成透明圈，不过前面的方法更为灵敏。

三、实验仪器和药品

仪器： 小铁铲、培养皿10个 、1ml移液管（1根）、1ml无菌移液管（1根）、10ml移液管（1根）、酒精灯（1个）、洗耳球（1个）、玻璃棒 、250ml锥形瓶（2个）、电炉（1台）、石棉网、洗瓶（1个）、涂布棒（1根）标签（若干）、PH试纸（若干）、棉花（若干）、纱布（若干）、报纸（若干）、绳子（若干）

试剂：1mol/L NaOH、1mol/L Hcl、生理盐水 （0.9%）

培养基：

滤纸条筛选培养基配方：滤纸条：0.5g、蛋白胨：0.5g、KH2PO4：0.1g、MgSO4·7H2O：0.05g、酵母粉：0.05g、琼脂：1.5g、水：100ml、PH：7.0

实验步骤：

1、玻璃器皿进行灭菌

2、培养基的配制：称重→溶化→调PH→定容

3、分装、制作斜面培养基 将制备好的两种培养基分装到试管中（1/5），每种培养基装两个试管，加上棉花塞，包扎，灭菌，摆斜面；贴上标签；

将剩余的培养基分别装到两个三角瓶中，包扎，灭菌；

安徽农业科学．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａ　．Ｓｃｉ．２００８。３６（１９）：７９５４—７９５５。７９６０　责任编辑孙红忠责任校对况玲玲　

纤维素酶提取工艺及酶学性质的研究　

缪静　，张术臻２，程显好　，冯志彬　，王营营　

（１．鲁东大学生命科学学院，山东烟台２６４０２５；２．北京中棉紫光生物科技有限公司，北京１０００４４）　

摘要［目的］探讨纤维素酶的最佳提取工艺和最佳反应条件。［方法］以里氏木霉Ｒｕｔ　Ｃ．３０为发酵菌种，在３ｏ℃、摇床转速１７０　ｒ／ｍｉｎ条　

件下培养８　ｄ，发酵生产纤维素酶，用盐析技术对粗酶液进行分离纯化，通过正交实验法探讨了纤维素酶的提取工艺条件。并以羧甲基　

纤维素钠酶活力为指标，对该酶的最佳反应条件和稳定性进行了研究。［结果］纤维素酶的最佳提取条件是：提取时间为１６　ｈ、盐析饱和　

度为７０％、ｐＨ值为４＿８。纤维素酶的最佳反应条件是：ｐＨ值为４．８、温度为６０℃。酶在ｐＨ　３．６—７．０时较稳定，在７８℃保温３０　ｒａｉｎ下的　

残留酶活为５ｏ％。『结论ｌ该研究为酶的工业化生产提供参考数据。　

关键词里氏木霉；纤维素酶；提取；酶学性质　

中图分类号Ｑ８１４，１　文献标识码Ａ　文章编号０５ｌ７—６６１ｌ（２１７０８）１９—０７９５４—０２　

Ｓｔｕｄｙ　０ＩＩ恤ＥｘＩ　Ｉｃ劬Ｔｅｅｌｍｏｌｏ￣ａｎｄＥｍ　曲ｔｉｃ　Ｐｎ师删ｅｓ　０ｆＣｅｌｌ￣ｓｅ　

ＭＬＡｏ　Ｊｊｎｇ　ｅｔ　ａｌ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＬｉｆｅ　Ｓｅｉｅｎｅｅ，ｈ￣ｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎ￣ｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　２６４０　）　

】ｓＩ瑚ｄ　ＩＯｂｉｅｅｔｌｖｅｌ　Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆｔｈｅ　ｓｔｕｄｙｗａｓｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｅｈｎｏｌ￣；ｙ　ａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｅｌｌｕｌａｓｅ，【Ｍｅｔｈｏｄｌ　Ｗｉｄ１　Ｔｒ／ｃｈａ—　

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｒｕｔ　Ｃ一３０　ａｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｓ　ｉｎ．ｉｔｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｔ　３０℃ａｎｄ　ｒｏｔａｔｉｏｎ　ｓｐｅｅｄ　ｏｆｌ７０　ｒ／ｒａｉｎｆｏｒ　８　ｄｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｅｅｌｌｕｌａｓｅ　ｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ｒＩｌ１ｅ　

纤维素酶的生产工艺及分富提纯

:来帅艸学号：4 3晓三连通信工程

摘要：

纤维素酶是一种重要的酶产洗，是一种复合酶，主要由外切（3-葡 聚糖酶、切卩■葡聚毎酶和B •葡萄热苜酶等组成，还有很需话力的木 聚糖酶。由于纤维素酶亦饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨丸的 市场潜力，己菠国外业人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋勺酶之 后的第四大工业酶种，甚至亦中国完全有可能成为第一大酶种，因此 纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。是可以将•纤维素分鮮成 篆糖或单毎的蛋勺质。

关键词：发酵由；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电冰

Abstract:

Cellulase is an important enzyme products, a complex enzyme, mainly by

the exo- j3 -glucanase. en do- j3 -glucanase and 3-glucosidase and other

components, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has

great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has

been regarded as the fourth largest in dustrial enzyme after saccharifyi ng

enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to

become the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a

new growth point. Is a protein that can decompose cellulose into