细胞凋亡的流式细胞术检测精品PPT课件
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流式细胞仪ppt课件
DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
.
20
.
21
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测，成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
.
3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
.
4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期60页PPT
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
流式细胞仪检测凋亡和细胞 周期
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
END
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
流式细胞仪检测凋亡和细胞 周期
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
END
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
医学专题流式细胞凋亡分析PPT文档
细胞凋亡的基因调控
诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平 衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调 控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控 失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDS、 霍奇金淋巴瘤等。
细胞凋亡的基因调控
常见的凋亡基因及其蛋白：
1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。 bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制 作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后 途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑 制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、 p53、c-myc及生长因子等激发的凋亡。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与皮肤病：
自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病 等，其免疫异常与自身反应性T、B淋巴细 胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、 发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡 障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自 动消退有关。
细胞凋亡与疾病
缺血性脑损伤和缺血性心脏病：
以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是 由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明， 全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。 大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经 细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海 马CAI区的锥形细胞最为明显，要经过一个 潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细 胞凋亡。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与免疫系统疾病：
许多以免疫功能异常为主要特征的疾病 均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形 态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫 病的发生中起重要作用。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与免疫系统疾病：
当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成 变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机 体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。 在细胞凋亡过程中， CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及 CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作 用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤 激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的 强弱。
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相资料讲解ppt课件
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
二、实验原理（continued）
膜联蛋白检测法
基于形态学观察的染色法 基于DNA 片断化的检测法
细胞凋亡检测方法
Caspase酶分析法
流式细胞仪定量分析法
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
四、实验步骤
• 收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4×105细胞）。 • 培养过夜后，加入不同浓度的药液100μL，对照组加入同体积的高糖DMEM
液。 • 作用不同的时间后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇-
20℃固定24h以上。 • 离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂： 70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-
20℃保存），PI （650µg/ml，避光保存于-20℃）， PBS(pH 7.4，保存于4℃)
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
细胞凋亡的检测方法PPT课件
第17页/共20页
细胞凋亡检测技术的展望
目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。进行细 胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。 用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通 过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致,进入细 胞就又多了一层屏障。Allnexinv 及其变体、Sytl 一 CZA 和 APosense 家族的某 些分子的临床应用取决于它们研究的进展。相信随着对细胞凋亡认识的不断深入 和检测技术的发展,特异性更强、灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。
第15页/共20页
钙离子浓度变化检测
凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要信号通路：线粒体通路， 内质网通路，死亡受体通路。这些信号通路大部分与钙离子有关，最终都能激活凋亡执行者 Caspases3,水解各种细胞成分而使细胞凋亡。在钙离子信号与肿瘤细胞形成的三条通路中， 存在相互促进，互为因果的促凋亡蛋白酶，加速了肿瘤细胞的凋亡。虽有关钙离子信号调控 细胞凋亡的证据越来越多，但是钙离子如何激活这些凋亡调节因子的分子机制现在仍不清楚。 一旦完全认识了Ca与细胞凋亡的关系，必将为凋亡研究带来突破性进展，为疾病特别是肿瘤 细胞的治疗提供新的思路和手段。 优点：由于流式细胞术不能检测出群体细胞的异质性，但钙离子浓度变化检测能对多项生化 指标进测定，固该法由较高的优越性。
体内检测annexinvsynaptotagminic2aaposese细胞凋亡检测方法体外检测细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的dna片段化检测dnaladderelisa检测法细胞凋亡的线粒体膜电位的检测细胞凋亡的相关基因的检测凋亡促进基因的表达检测凋亡抑制基因的表达检测细胞凋亡的流式细胞术检测细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测形态学检测原理
细胞凋亡检测技术的展望
目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。进行细 胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。 用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通 过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致,进入细 胞就又多了一层屏障。Allnexinv 及其变体、Sytl 一 CZA 和 APosense 家族的某 些分子的临床应用取决于它们研究的进展。相信随着对细胞凋亡认识的不断深入 和检测技术的发展,特异性更强、灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。
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钙离子浓度变化检测
凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要信号通路：线粒体通路， 内质网通路，死亡受体通路。这些信号通路大部分与钙离子有关，最终都能激活凋亡执行者 Caspases3,水解各种细胞成分而使细胞凋亡。在钙离子信号与肿瘤细胞形成的三条通路中， 存在相互促进，互为因果的促凋亡蛋白酶，加速了肿瘤细胞的凋亡。虽有关钙离子信号调控 细胞凋亡的证据越来越多，但是钙离子如何激活这些凋亡调节因子的分子机制现在仍不清楚。 一旦完全认识了Ca与细胞凋亡的关系，必将为凋亡研究带来突破性进展，为疾病特别是肿瘤 细胞的治疗提供新的思路和手段。 优点：由于流式细胞术不能检测出群体细胞的异质性，但钙离子浓度变化检测能对多项生化 指标进测定，固该法由较高的优越性。
体内检测annexinvsynaptotagminic2aaposese细胞凋亡检测方法体外检测细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的dna片段化检测dnaladderelisa检测法细胞凋亡的线粒体膜电位的检测细胞凋亡的相关基因的检测凋亡促进基因的表达检测凋亡抑制基因的表达检测细胞凋亡的流式细胞术检测细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测形态学检测原理
流式细胞术原理及应用简介PPT课件
淋巴细胞亚群分析实验步骤 Forward Light Detector
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
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Ø 凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等 的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜 所包围； Ø 凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
1.2 细胞坏死
Ø 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的 反应。
Ø 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 Ø 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
ü 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所 占的比率。
ü PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可 以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较
ü 该法简便、标本制备容易、检测费用低
ü 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰 相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现 ，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其 他方法进行检测
不开的最基本生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数 目，清除衰老、过剩、有害的细胞。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
Ø 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞 脱离，细胞质中线粒体大体完整，染色质固缩；
Ø 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细 胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2 细胞凋亡的流式检测方法
3 流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
Ø 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀 现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的 程序，自我结束生命的死亡方式。
Ø 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) Ø 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离
ü Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ü Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本
相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ü Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进
入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4 随后会和钙离子结合并发出荧光。
5.炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症 反应
主动过程，有新蛋白合成， 耗能
胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩，核固缩溶酶体相对完整，局部 Nhomakorabea炎症反应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp）， 电泳呈“梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ü 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变
小，SSC增大 ü 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ü 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、
SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变 小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 2.1 PI单染检测 Ø 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 Ø 2.3 细胞内钙离子测定 Ø 2.4 线粒体膜电位检测 Ø 2.5 Caspases细胞酶的检测 Ø 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU Ø 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
ü 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此 时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
ü PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整 性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的 完整性已经丧失， Annexin V可以进入到细胞浆内，与位 于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈 现绿色荧光。
ü 此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7AAD )双染色是检测早期凋亡 细胞的敏感方法。
2.1 PI单染检测
ü 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。
ü 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序 降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经 乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的 DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方 图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
ü 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
ü Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后 经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当 Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以 上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成 正比。
细胞凋亡与细胞坏死的区别
——————坏死—————————凋—亡———
———————————————————
1.性质
病理性，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成， 不耗能
4.形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
ü 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下， PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并 暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
ü Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V， 就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨 酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
2.4 线粒体膜电位检测
ü JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
ü 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中， 形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞
1.2 细胞坏死
Ø 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的 反应。
Ø 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 Ø 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
ü 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所 占的比率。
ü PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可 以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较
ü 该法简便、标本制备容易、检测费用低
ü 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰 相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现 ，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其 他方法进行检测
不开的最基本生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数 目，清除衰老、过剩、有害的细胞。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
Ø 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞 脱离，细胞质中线粒体大体完整，染色质固缩；
Ø 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细 胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2 细胞凋亡的流式检测方法
3 流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
Ø 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀 现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的 程序，自我结束生命的死亡方式。
Ø 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) Ø 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离
ü Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ü Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本
相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ü Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进
入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4 随后会和钙离子结合并发出荧光。
5.炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症 反应
主动过程，有新蛋白合成， 耗能
胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩，核固缩溶酶体相对完整，局部 Nhomakorabea炎症反应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp）， 电泳呈“梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ü 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变
小，SSC增大 ü 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ü 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、
SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变 小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 2.1 PI单染检测 Ø 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 Ø 2.3 细胞内钙离子测定 Ø 2.4 线粒体膜电位检测 Ø 2.5 Caspases细胞酶的检测 Ø 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU Ø 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
ü 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此 时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
ü PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整 性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的 完整性已经丧失， Annexin V可以进入到细胞浆内，与位 于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈 现绿色荧光。
ü 此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7AAD )双染色是检测早期凋亡 细胞的敏感方法。
2.1 PI单染检测
ü 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。
ü 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序 降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经 乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的 DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方 图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
ü 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
ü Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后 经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当 Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以 上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成 正比。
细胞凋亡与细胞坏死的区别
——————坏死—————————凋—亡———
———————————————————
1.性质
病理性，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成， 不耗能
4.形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
ü 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下， PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并 暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
ü Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V， 就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨 酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
2.4 线粒体膜电位检测
ü JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
ü 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中， 形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞