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基因敲除技术及其进展

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基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用

The Current Status of Gene Knockout

and its Application in Metabolic

Engineering

天津大学化工学院

二零壹六年六月 摘 要

基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。

关键词： 基因敲除 代谢工程 同源重组 CRISPR/Cas9

ABSTRACT

Gene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed

sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform

of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced

the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four

new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At

last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further

discussed.

KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous

recombination, CRISPR/Cas9

目 录

第一章 基因敲除技术 ........................................................................................... 1

1.1基因敲除相关背景 ................................................................................... 1

1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 ....................................................... 2

第二章 基因敲除策略 ........................................................................................... 3

2.1传统的基因敲除策略 ............................................................................... 3

2.1.1利用同源重组进行基因敲除 ........................................................ 3

2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 ................................................ 4

2.2新兴的基因敲除策略 ............................................................................... 5

2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 ................................................ 5

2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 ........................................................... 5

2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 ....................................................... 6

2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 ...................................................... 7

第三章 前景展望 ................................................................................................... 9

参考文献 ............................................................................................................... 10

致谢 ....................................................................................................................... 11

第一章 基因敲除技术

1 第一章 基因敲除技术

1.1基因敲除相关背景

随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。

基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础，

经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的Nature Methods杂志评选为年度研究方法[3]。2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。

基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。

然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2） 敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉

一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能；3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；4）实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大[6]。 第一章 基因敲除技术

2 1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用

具体而言，代谢工程是利用基因工程技术或其他物理、化学方法对细胞的代谢途径进行精确地修饰与改造，对细胞内目标物质的代谢流进行扩展、减小、阻断或构建新的代谢途径，从而有目的、有理性地改变微生物原有代谢特性，改进或者构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学[7]。

代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途径。在发酵生产中, 为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[8]，即：a. 使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；b. 阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；c. 消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。在上述各过程中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。

通过基因敲除技术，可研究被敲除基因的生物学功能，还可以进行功能基因的插入及染色体基因的替换，进而可以阻断微生物细胞的代谢旁路，减弱毒/副作用，强化目标产物的产量或质量，降低能耗，从而成为具有重要工业应用价值的微生物细胞工厂研究中的重要内容[9]。 第二章 基因敲除策略

3 第二章 基因敲除策略

以下本文将通过两个方面讲述基因敲除技术，一是传统的基因敲除策略；二是新兴的基因敲除策略。并对这些策略做一些简单介绍以及概括。

2.1传统的基因敲除策略

2.1.1利用同源重组进行基因敲除

经典的基因敲除策略是利用上述同源重组基本原理，通过体外改造一定长度/形式的基因，与细胞染色体上的靶基因发生同源重组 (插入或置换)，从而改变细胞的遗传特性。

从同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的底物类型 (单链/双链、线性/环状)、重要蛋白 (RecA 酶、RecBCD 酶等及噬菌体中具有相似功能的酶) 和功能位点 (Chi 位点) 等进行分子设计，即可开发出各种不同的基因敲除方法，根据同源重组载体的不同，可以把基因敲除方法分为线性单链 DNA

(ssDNA)、线性双链 DNA(dsDNA) 以及环状双链DNA (质粒载体) 等3类：

1. 线性单链 DNA 敲除策略不但打靶载体易于构建，且其重组效率是双链

DNA的10~100倍[10]；

2. 采用线性双链DNA进行同源重组，是近年来基因敲除方法的热点之一。其优点是可以避免较为繁琐的基因克隆和质粒载体构建步骤，而直接采用PCR方法扩增获得目标同源重组片段。然而，线性双链DNA 易于被细胞内的 RecBCD 酶降解，为了解决上述问题，可以在线性双链

DNA 的两侧引入Chi位点，保护DNA不被 RecBCD 酶降解，并能强化RecBCD 酶介导的同源重组效率[11]。

3. 构建环状质粒载体进行目标基因敲除的方法，是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物 本 身 的 RecA 重 组 系 统 ( 主 要 包

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pk18mobsacb基因敲除原理

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PK18MOBSACB基因敲除原理

引言：

基因敲除是一种常用的分子生物学技术，可以通过干扰目标基因的表达来研究其功能。PK18MOBSACB是一种常见的基因敲除工具，本文将以PK18MOBSACB基因敲除原理为标题，探讨其工作原理及应用。

一、PK18MOBSACB基因敲除原理概述

PK18MOBSACB是一种基因敲除工具，其原理主要包括以下几个步骤：

1.构建敲除载体：首先，需要构建一个敲除载体，该载体通常包含目标基因的上下游序列、抗性基因等。构建敲除载体的目的是将其导入到目标细胞中，并实现目标基因的敲除。

2.导入敲除载体：将构建好的敲除载体导入到目标细胞中，可以通过化学法转染、电穿孔法、病毒载体转染等方法实现。

3.选择性筛选：导入敲除载体后，需要进行选择性筛选，以筛选出已经发生基因敲除的细胞。通常使用特定培养基或添加抗生素来选择带有敲除载体的细胞。

4.鉴定敲除细胞：通过PCR、Western blot、克隆测序等方法，对筛选出的细胞进行鉴定，确定是否成功实现了目标基因的敲除。

二、PK18MOBSACB基因敲除原理详解

1.PK18MOBSACB基因敲除载体的构建

PK18MOBSACB基因敲除载体的构建是基因敲除实验的关键步骤之一。一般而言，敲除载体由多个部分组成：目标基因的上下游序列、选择性标记基因和辅助基因等。

2.导入敲除载体

将构建好的PK18MOBSACB基因敲除载体导入到目标细胞中，是实现基因敲除的关键步骤。目前常用的导入方法包括化学法转染、电穿孔法和病毒载体转染等。这些方法都可以有效地将敲除载体导入到目标细胞中。

3.选择性筛选

导入敲除载体后，需要进行选择性筛选，以筛选出已经发生基因敲除的细胞。常用的选择方法是添加抗生素或使用特定培养基。这些方法可以选择出带有敲除载体的细胞，进一步进行后续的鉴定工作。

4.鉴定敲除细胞

经过选择性筛选后，需要对敲除细胞进行鉴定，以确定是否成功实现了目标基因的敲除。常用的鉴定方法包括PCR、Western blot、克隆测序等。通过这些方法，可以检测目标基因的缺失或表达水平的变化，从而确定敲除细胞的有效性。

大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介

大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介

1 CRISPR-Cas系统的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。

受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。

2 CRISPR-Cas系统的组成与机制

典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。

Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。

Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)[7]。当外源噬菌体或质粒首次入侵时，宿主菌通过识别PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到CRISPR基因座中，形成新的间隔序列。

同源重组基因敲除原理

同源重组基因敲除原理

未知驱动探索，专注成就专业

1

同源重组基因敲除原理

引言

随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。

基本原理

同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。

在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。

步骤

同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：

1. 设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。 未知驱动探索，专注成就专业

2

2. 制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。

3. 细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。转染后，对细胞进行培养和筛选。

4. 筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。

5. 鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。

应用场景

同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：

基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略

基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略

基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略

一、本文概述

随着生物科技的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物医学研究的重要工具。其中，CRISPR-Cas9技术以其高效、精确的特性，在基因敲入敲除策略中展现出了巨大的潜力。本文旨在全面介绍基于CRISPR-Cas9技术的基因敲入敲除策略，包括其原理、应用、优缺点以及未来的发展趋势。通过对这一技术的深入剖析，我们期望为科研人员提供一个清晰、全面的视角，以更好地理解和应用CRISPR-Cas9技术，推动生物医学领域的研究进展。

二、CRISPR-Cas9技术的基本原理

CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）技术是一种强大的基因编辑工具，它源自细菌的自然防御机制，即CRISPR系统。这一系统允许细菌存储并记忆过去遭遇过的病毒DNA片段，以便在未来遇到相同病毒时，能够识别并切割这些病毒DNA，从而抵抗病毒感染。CRISPR-Cas9系统通过这一机制被改造为一种精确的基因编辑工具，用于在真核细胞（如人类细胞）中进行基因敲除和敲入操作。

CRISPR-Cas9技术的基本原理可以分为三个主要步骤：目标识别、DNA切割和修复。一个由RNA和Cas9蛋白组成的复合物被设计用来识别特定的DNA序列。这个RNA分子，通常被称为单链导向RNA（sgRNA），能够与Cas9蛋白结合，并指导Cas9蛋白在目标DNA序列上定位。sgRNA的设计是关键，它必须能够准确地与目标DNA序列配对，以确保Cas9蛋白能够在正确的位置进行切割。

一旦Cas9蛋白在目标DNA序列上定位，它就会切割DNA双链，产生一个双链断裂（DSB）。细胞对DSB的修复机制有两种主要方式：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。NHEJ是一种错误易发的修复方式，它通常会导致DNA序列的插入、删除或替换，从而导致基因功能的丧失，这种机制常被用于基因敲除。而HR则需要一个与断裂DNA序列同源的模板，以指导修复过程，这种方式可以用于精确的基因敲入。