PCR分子实验室污染分析及解决对策

PCR污染及解决对策PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术，可以迅速繁殖起源于低数量的DNA片段。

然而，由于PCR技术的超高敏感性，PCR污染成为了一个严重的问题，会对实验结果产生误导，因此需要采取一系列的对策来解决PCR污染问题。

其次，采取有效的对策来解决PCR污染问题非常重要。

首先，严格控制实验环境是避免PCR污染的基本要求。

实验室应保持清洁，定期对实验室设备和试剂进行彻底消毒，避免其他DNA或RNA的污染。

其次，使用高质量的试剂是减少污染的关键。

应选择经过严格质检的PCR试剂，并确保避免任何外源DNA或RNA的污染。

此外，在制备PCR扩增产物的过程中，应使用专门的PCR试剂和设备，避免将外源DNA或RNA引入PCR反应体系。

另外，对于系统性污染，还可以采取一系列的措施来解决。

首先，必须严格控制实验员的操作技术。

实验员应该接受专业培训，掌握正确的实验操作技巧，避免将DNA或RNA带入反应体系。

其次，必须在每一步操作中使用专门的实验室试验装备，如PCR工作站、个体工作站、滤器、独立的试剂架等，严格把控反应体系的洁净度。

此外，还可以定期检查实验室设备和试剂并进行维护，确保其正常运行和清洁卫生。

最后，对于偶然污染，需要在每一次PCR反应中都非常小心地进行操作。

实验员应严格遵守操作规程，避免交叉污染。

此外，可以通过定期更换试剂的使用日期、采用质控样品、引入阴性对照等方法，以确保PCR反应的准确性和可靠性。

综上所述，PCR污染是一个常见但严重的问题，会严重干扰PCR实验的结果。

为了解决PCR污染问题，实验室应该加强实验环境的控制，使用高质量的试剂和设备，并确保实验员具备良好的操作技术。

此外，对于系统性污染，还可以进行定期检查和维护，对污染源进行有效控制。

通过采取这些对策，可以最大限度地减少PCR污染，提高实验结果的准确性和可靠性。

PCR实验室污染与对策PCR（Polymerase Chain Reaction）实验室是进行核酸分析和生物学研究的重要场所。

然而，由于PCR实验室使用高灵敏度的技术，可能会受到外源性DNA污染的影响，导致结果的失真甚至错误。

因此，PCR实验室污染的问题需要引起重视，并采取相应的对策来减少对实验结果的影响。

外源性污染主要指的是在实验室环境中引入外部DNA污染源。

这些污染源可能包括实验室用具（如罗氏管、管盖、显微镜片等）、实验材料（如引物、模板DNA等）、工作人员（如手部皮肤上的DNA）以及空气中的微生物等。

为了减少外源性污染，可以采取以下对策：1.消毒和清洁实验室：实验室应定期进行彻底的清洁和消毒，包括工作台、工具和设备等。

使用消毒剂对工作台和设备进行彻底的消毒，防止污染源的交叉感染。

3.使用无DNA污染的试剂和材料：选用经过严格筛选和检测的PCR试剂和材料，确保其无DNA污染。

同时，使用专门为PCR实验设计和包装的罗氏管和管盖，减少外源性DNA污染的可能。

4.严格的实验室操作规范：建立和执行严格的实验室操作规范，包括实验室的通风设施、培训工作人员、制定标准操作流程等。

工作人员应按照规范操作，遵守实验室操作规程，确保实验的准确性和可靠性。

内源性污染是指实验过程中引入的内源性DNA污染。

内源性污染通常是由前一PCR扩增反应的产物污染了下一PCR反应。

1.严格控制实验操作的顺序：按照从低到高浓度的样品进行PCR扩增。

首先进行阴性对照，检测PCR反应体系中是否存在污染。

然后进行低浓度样品的扩增，最后进行高浓度样品的扩增，以减少内源性污染的可能。

2.应用反转录酶酶和RNA不是DNA模板：在RNA模板的PCR扩增反应中，可以使用反转录酶酶将RNA转录成cDNA。

由于RNA是DNA的模板，反转录过程不会引入外部DNA污染，从而减少内源性污染的可能。

3.使用消除污染酶：在每一PCR扩增反应中加入消除污染酶，可以在扩增反应结束后对DNA污染进行降解。

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策摘要：PCR技术已经成为动物疾病检测的重要方法之一，然而，由于试剂、设备以及实验操作等因素的原因，PCR实验室中常常会存在污染现象，这会对PCR检测结果产生重大的影响。

本文主要介绍PCR实验室常见的污染问题及其对策，以期提高PCR检测的准确性和可靠性。

关键词：PCR；实验室；污染；对策一、PCR实验室常见的污染问题1.叉板污染。

在PCR实验的初级放大反应中，管盖内部会被热化，空气会从管盖缝隙中进入反应体系，从而引入外源DNA分子，使PCR反应体系中出现不必要的“叉板”污染。

2.辅助设备污染。

如离心机、手持式均质器、移液器、试剂瓶和移液器架等都会存在洁净度和污染问题。

特别是存在抗生素残留的试剂盒容易产生细菌污染，影响PCR检测结果。

3.PCR产物污染。

PCR产物污染主要是指PCR反应体系中存在外源DNA，如试剂、PCR产物以及PCR操作过程中的污染。

一旦外源DNA进入PCR反应体系中，会扰乱PCR放大反应，导致false positive或false negative结果。

因此，一般情况下，实验室流程分离是非常重要的。

1.建立完善的实验室管理制度。

要求从实验室建设、操作规程、用品消毒等方面入手，从细节把控污染源。

2.请专业的清洁事务公司进入实验室定期清洁和卫生消毒，保持实验室的清洁和洁净度。

3.实验过程中采用无菌技术。

如在采样、制备PCR反应混合液等步骤中要保证使用无菌物品，并在干燥灭菌下操作，百分百排除污染问题。

4.建立实验操作流程分离制度，将不同阶段的实验操作由不同工作人员完成，避免在同一实验室内同时进行制备源DNA和PCR反应等操作，降低交叉感染发生的可能性。

5.配置优质耗材。

实验用器具、管盖、移液器等耗材来源要可靠，使用前要经过充分的消毒，并且尽量使用纯净物品，避免使用重复已知污染的器具和耗材。

6.严格控制DNA扩增过程的负性对照，在PCR反应前和PCR反应后提取DNA进行扩增负性对照，诊断异常污染。

PCR实验室主要污染源与防污染措施1. PCR实验室主要污染源（1）临床样本中存在的⼤量待测微⽣物；（2）科研中得到的质粒克隆；（3）以前分析研究的特定微⽣物；（4）⼤量存在于实验环境中的特定微⽣物；（5）以前扩增产物的残留污染。

这也是PCR实验室最容易产⽣的将造成假阳性的污染。

PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的积累，通常，⼀次典型的PCR扩增可以产⽣10^9拷贝的靶序列，如果⽓溶胶化，甚⾄最⼩的⽓溶胶都会含有10^6拷贝的扩增产物。

如果不加以控制，在短期内累积的⽓溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统，从⽽造成严重的实验室污染，出现⼤量的假阳性结果。

⼀些RNA扩增技术如基于核酸序列的扩增（NASBA）、转录介导的扩增（TMA）和Qbeta复制酶等不易产⽣扩增产物的污染，这是由于它们的扩增产物为RNA，可以被环境中的RNA酶迅速地降解。

2. 防污染措施（1）严格分区实验室及严格遵守⼯作程序基因扩增实验室分为试剂准备区、样本准备区、PCR扩增区、产物分析区等，必需备有各⾃必需的仪器设、⼯作服、⼿套、加样器和通风系统。

在每个区使⽤的试剂和废物，必需直接在其各⾃的区域内分装或包装。

操作⼈员必需注意防⽌通过他们的头发、眼睛和⾐服将扩增产物从污染区携带⾄清洁区的可能性。

（2）化学清污实验台⾯可使⽤10%的次氯酸钠（漂⽩剂）清洗，然后再⽤70%⼄醇或清⽔洗去次氯酸钠。

次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作⽤，从⽽使可能留在实验台⾯的扩增产物被破坏掉。

要注意的是，次氯酸钠不能区分提取的DNA和PCR扩增产物，⽤次氯酸钠处理的样本不能⽤于核酸扩增检测。

在实际⼯作中，有些物品⽐如放置扩增反应管的盘必需从污染区转回清洁区时，在转回之前，应将其置于2-10%的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。

（3）扩增产物的修饰临床PCR检测通常由3或4个步骤组成：核酸提取和扩增检测试剂的配制。

使⽤商品试剂盒时，试剂的配制量可⼤⼤减少；样本的处理即靶核酸的提取；PCR扩增；扩增产物的分析。

PCR实验室发生污染后处理方法PCR实验室发生污染后处理方法一、确定污染类型1、PCR实验室发生污染后主要表现为：1）所有同批次标本及阴阳对照全部为阳性；2）阴阳对照正常，所有标本检测均为阳性；3）除了CT值靠前的标本其余标本及阴性对照CT值接近临界值，都有微弱翘尾。

出现以上三种情况，均可判为发生污染。

PCR污染类型分为样本污染和产物污染。

所谓样本污染一般发生在操作2区，由使用被污染的耗材和样本交叉污染产生；产物污染有PCR扩增产物引起，一般发生在扩增分析区，即3区，由于PCR反应体系没有完全闭合或者扩增后的体系没有及时安全清理引起。

2、确认污染类型才能有效清除污染。

发生污染后，更换所有一次性耗材即移液枪及使用新拆分试剂。

有两种简易方法如下：1）不加内标重复实验，检测结果如果内标没有扩增，可判为样本污染，反之为产物污染。

2）分A和B两组，A组在上机前，八联管开盖在2区放置10min 左右，B组闭合八联管直接上机。

检测结果中若A组发生污染B组正常，则为气溶胶污染。

气溶胶污染有两个来源，其一为扩增产物引起，其二为浓度较高的标本在制备过程中外释累积形成。

二、污染处理措施一般而言，发生产物形成的气溶胶污染是很难在短时间内及时清理掉的，这是由PCR反应的特点决定的，及其微小的污染物都可以作为模板扩增，释放出巨大荧光信号。

因此，很多试剂厂商都有相应的防污染试剂产品，可以有效防止产物污染，其原理为UNG酶对产物核酸片段的有效降解，而不影响我们从标本制备来的核酸模板。

但是，彻底消除污染，降低对UNG酶的依赖，还需要一套消除污染的体系来应对。

具体如下：1、全面规范操作：1）进行PCR操作时，工作人员应该严格遵守SOP操作规程。

2）试剂准备、标本制备区、PCR扩增区及分析区设计要合理，要有一定的方向性。

工作人员要谨循由试剂准备→标本制备→PCR扩增区及分析区的工作流程。

3）任何一间的产物及器材不要拿到其它两个工作区。

【分享】PCR污染与对策PCR污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.对照试验1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行PCR扩增防止污染的方法一．污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。