6. 荧光分光光度法

第六节 分光光度法

(一)基础知识

分类号：W6-0

一、填空题

1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的 ，对待测组分进行定量测定。

答案：吸光度(或吸光性，或吸收)

2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的 ，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。

答案：符合程度

3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。可用 涮洗，或用 浸泡。注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。

答案：相应的溶剂 (1+3)HNO3

二、判断题

1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。( )

答案：正确

2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。( )

答案：正确

3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。( )

答案：错误

正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。

4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。( )

答案：错误

正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。

5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。( )

答案：错误

正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。

三、选择题

1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中 不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。( )

荧光分光光度法的名词解释

荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。

一、荧光现象解析

1. 光激发与光发射

在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。

2. 荧光寿命

荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。

二、荧光分光光度法的原理

1. 荧光光谱分析

荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。

2. 荧光光度法

荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。

三、荧光分光光度法的应用

1. 化学分析

荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。

2. 生物医学研究

荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。

书山有路勤为径，学海无涯苦作舟

可见分光光度法显色条件的选择

显色条件主要包括显色剂用量、酸度、显色温度、显色时间等，这些条件

对分析结果有很大影响，因此必须通过实验认真选择这些条件。1.显色剂用量

显色剂的适宜用量一般是由实验确定的。其方法是：在一系列含有相同浓度

待测组分的溶液中加入不同量的显色剂，然后在相同条件下测量其吸光度。选

择吸光度稳定区域显色剂的用量作为实际分析时显色剂用量。

2.酸度

酸度对显色体系的影响主要表现在以下三个方面：

（1）对显色剂的影响。许多显色剂都是有机酸（碱），介质酸度的变化将直

接影响显色剂的离解程度和显色反应能否进行完全。

（2）对被测金属离子的影响。当介质酸度降低时，许多金属离子会发生水

解，形成各种型体的羟基配合物，甚至析出沉淀，使显色反应无法进行。

（3）对有色配合物的影响。对于某些能形成逐级配合物的显色反应，产物

的组成会随介质酸度的改变而不同。

由此可见，介质酸度是影响显色反应的重要因素。显色反应的最佳酸度可通

过实验确定。其方法是固定溶液中被测离子和显色剂的浓度，改变溶液的酸

度，测量各溶液的吸光度，绘制 A-pH 曲线，从中找出最佳 pH 范围。

3．显色温度

多数显色反应在室温下能迅速进行，但有些反应需适当提高温度。例如，以

硅钼蓝法测硅时，生成硅钼黄的反应在室温下需几十分钟才能完成，而在沸水

浴中 30s 即可完成。对于某些显色反应，温度升高会降低有色配合物的稳定

性。例如钼的硫氰酸配合物，在 15-20℃时可稳定 40h，当温度超过 40℃,12h

就完全褪色。书山有路勤为径，学海无涯苦作舟

4．显色时间

由于反应速度不同，完成显色反应的时间也各异。有些反应瞬时完成，而且

完成后有色配合物能稳定很长时间，例如偶氮胂Ⅲ与稀土的显色反应。有些反

应进行得较慢，一旦完成，稳定时间也较长。例如钛铁试剂与钛的显色反应。

有些显色反应虽能迅速完成，但产物会迅速分解。例如丁二酮肟与镍的显色反

荧光分光光度计

Fluorescence Spectrometer

国别厂家：日本岛津公司

仪器型号：RF-5301PC

基本原理：

主要技术指标：

灯 源：150 W Xe灯

单 色 器：闪耀式全息光栅，F2.5刻线1300条/mm

波长范围：220900 nm.

波长精度：±1.5 nm, 分辨率：1.0 nm

狭 缝 宽:1.5, 3, 5, 10, 15, 20 nm

灵 敏 度: S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时）

测定方式：荧光光谱测定、定量测定、时间过程测定

软件功能：10通道显示,数据RSC转换, 谱图自动找峰,不同谱图加减乘除, 谱图倒数、导数、常用对数转换等。

主要功能:

固体和液体的激发光谱、发射光谱和同步荧光光谱；荧光物质的定量分析。

第一单色器

记录仪

第二单色器 荧光 光源

激发

样品池

使用方法：

1. 将荧光光度计的右侧Xe灯开关置于“ON”的位置, 再打开电源开关和电脑电源。

2. 双击电脑上的RF-5301PC图标, 静等仪器自检完成,出现喀嚓声后, 显示RF-5301P窗口。

3. 预热：开机预热20分钟后才能进行测定工作。

4. 新建文件夹：在Data文件夹里新建本次所做实验的子文件夹

5. 启动RF-5301PC后在Acquire Mode中选择欲分析的项目。

6. 设定参数：根据测量方式在Configure的Parameter里设定合适的参数。

7. 置入样品：将已经装入样品的四面擦净后的石英荧光比色皿放入样品室内试样槽后, 将盖子盖好。

8. 扫描：参数设定完毕后, 点击窗口右下角的“Start”图标,开始扫描, 扫图结束后输入文件名将文件储存。

9. 保存：在“File”中的“Save Channel”对曲线进行保存。

10. 转换文件：在“File”的“Data Translation”里单击要转换的“ASCⅡ”格式或者“DIF”格式。