病毒的提纯

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。

在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。

它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。

在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。

脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。

病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

现在我们讲解每个步骤的一些细节。

1.在大型装置中培养细菌。

为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。

每种病毒的培养都有不同的步骤。

脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。

在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。

2.富含病毒培养液的去除。

病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。

在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。

为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。

然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。

低速离心除去大分子的细胞残骸。

3.通过沉淀将病毒物质浓缩。

由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。

脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。

这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。

由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。

将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。

然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。

这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。

4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。

脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。

病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。

组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。

2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。

4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。

5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。

6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。

7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。

8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。

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病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。

病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。

病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。

物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。

病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。

病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。

免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。

结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。

病毒纯化方法:1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。

但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。

2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。

Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。

密度梯度离心法英文名称： density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。

(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。

(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。

(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。

(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。

(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

第十四章病毒和病毒成份的提纯一、病毒的提纯(一)沉淀法(二)层析法(三)两相溶剂间分配系数法(四)红细胞吸附法(五)电泳法(六)超速离心法(七)超滤法二、病毒蛋白亚单位的分离三、病毒脂质的抽提四、病毒糖类的抽提一、病毒的提纯所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。

病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。

病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。

1.物理均一性测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。

2.病毒滴度与蛋白含量的比例测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。

病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。

3.免疫学反应免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。

4.结晶形成病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。

病毒提纯的主要依据和条件有:(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。

有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。

实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。

通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～ 6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).3. Stir at 4℃for 2 hours.4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。

在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。

将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。

Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机（BECKMAN OPTIMAL-80XP）50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机（BECKMAN AVANTIJ—26XP）20000～25000rpm 最大离心力为89000×g;超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra—clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃,4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中.（2）取6个Beckman超速离心管，70％乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra—clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清.（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液（PBS配制）。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中.另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心,25000rpm (82700g）2 h.（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液,留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min,并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡.（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。